一种重组人胰岛素结晶的制备方法技术

本发明专利技术提供一种重组人胰岛素结晶的制备方法，属于蛋白质结晶技术领域，该制备方法中使用锌离子，并进行三次结晶后，所得胰岛素结晶粒径大、均一性好，该方法不加入常规方法中使用的酚类和有机溶剂，避免了产品中有害物质的残留，提高了胰岛素结晶的质量，且制备工艺稳定，有利于工业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种重组人胰岛素结晶的制备方法，具体涉及一种重组人胰岛素三次结晶的制备方法，属于蛋白质结晶

技术介绍
糖尿病是多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，是由于体内胰岛素绝对或相对缺乏或靶组织对胰岛素不敏感而引起的综合病症。近年来，随着人们生活水平的改善，糖尿病的发病率呈现出逐年上升的趋势，成为仅次于心血管和肿瘤的第三大致死疾病。糖尿病及其并发症的发生，不仅给患者带来极大的痛苦，还给个人、家庭和社会带来了沉重的经济负担。使用胰岛素是使糖尿病患者血糖达标的重要手段。结晶是胰岛素及其类似物原料药生产的重要环节，然而现有技术中胰岛素及其类似物的结晶过程中大多均需添加酚类物质(申请号如：201510334795.4、201510176512.8)、有机溶剂(例如乙腈、乙醇等)、除锌离子以外的其他阳离子，如钠离子(ZL02113186.4)，这些挥发性差和/或毒性高的化学物质的残留会严重影响胰岛素终产品的质量。例如苯酚是一种有毒溶剂，挥发性较差，有强腐蚀性，对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，同时还会抑制中枢神经系统或损害肝、肾功能等。胰岛素及胰岛素类似物市场巨大，目前未有胰岛素结晶或胰岛素类似物结晶过程中无需添加酚类物质、有机溶剂就可成功获得结晶的相关报道。因此，无论是在临床需要，还是工业生产上，迫切需要一种人胰岛素结晶的制备方法，无需加入酚类及其衍生物、有机溶剂、钠离子等试剂，能够得到一种颗粒大、沉降速度快、便于分离、杂质低残留的人胰岛素结晶，所得的人胰岛素结晶纯度要高，便于工业生产。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种重组人胰岛素结晶的制备方法，该方法具有以下优点：在结晶过程中不需要加入钠离子、酚类物质和有机溶剂就能够成功制备出重组人胰岛素结晶。所述方法由以下步骤组成：1)将含有重组人胰岛素的反向高效层析液，加入锌盐溶液，使每OD280nm的重组人胰岛素中含有锌离子的浓度为10-55mg/ml,加入低温纯化水，当胰岛素溶液浓度稀释到0.5-6mg/ml时，搅拌；2)向步骤1)中胰岛素溶液加入3-5M的氨水进行调沉，直到pH为5.5-7.5之间时，停止搅拌，得到一次结晶液；将一次结晶液转移至一结结晶罐中静置沉降，沉降后，测定上清液OD280nm小于等于0.2时，排除上清液,得到一结结晶；3)将一结结晶转移到二结调沉罐中，向二结调沉罐中加入1-3M醋酸进行溶解，搅拌，待一结结晶完全溶解后停止添加醋酸和搅拌，然后向罐中补入常温纯化水，使其稀释浓度为3-18mg/ml；4)继续搅拌，待溶液搅拌均匀后进行调沉，向罐中加入3-5M氨水调节溶液pH值至5.5-7.5，停止搅拌，观察晶体，待晶体形成后，得到二次结晶液；将二次结晶液转移至二结结晶罐中静置沉降，沉降后，测定上清液OD280nm值小于等于0.2时，将上清液排掉；得到二结结晶；5)向二结结晶罐中加入常温纯化水,搅拌，加入1-3M醋酸，待结晶完全溶解后停止添加醋酸和搅拌；6)向步骤5)的二结结晶罐中补加锌盐溶液，使其锌离子浓度为0.3-1.6×10—4mg/ml，搅拌均匀后，经无菌滤芯过滤后，转移至已经灭菌的三结调沉罐中；7)向三结调沉罐中加入常温注射用水，稀释浓度范围为3-18mg/ml，搅拌；8)向步骤7)的三结调沉灌中加入3-5M氨水溶液调节溶液pH值，当溶液pH值调至5.5-7.5后，观察晶体，待晶体形成后，得到三次结晶液；将三次结晶液转移至三结结晶罐中，静置沉降，过滤，得到重组人胰岛素结晶。步骤1中，所述样品为重组人胰岛素的反向高效层析液，反相高效层析，是我们将得到的粗产品精纯的过程，是将粗产品经反相高效层析后得到的，内含成分就是重组人胰岛素、乙腈和醋酸铵，使用紫外分光法对重组人胰岛素浓度进行测定，使用紫外光n＝280nm，测定相应的OD280nm值，而经过我们的计算，1OD280nm对应的重组人胰岛素的浓度为1.1mg/ml。步骤1)为加入锌离子，稀释溶液，因为通过高效色谱进行纯化时，高浓度的重组人胰岛素层析液含有很多流动相物质，例如乙腈等，不利于沉淀，需进行稀释。步骤2和4中的调沉，目的是为了促进沉淀。加入低温纯化水，可以保持蛋白质的质量水平。本专利技术还提供了一种制备方法，其中步骤1)所述锌盐溶液为氯化锌；低温纯化水温度为2-8℃；胰岛素溶液稀释到4mg/ml。本专利技术充分考虑到了锌离子的量，如果锌离子浓度过高，会使结晶颗粒变小，甚至形成无定形沉淀，锌离子浓度过低，胰岛素沉淀不完全。其中pH值也是结晶的关键，根据人重组胰岛素等电点为4.5-5.5，本专利技术的结晶条件优选了5.5-7.5，更优选了5.5-6.5，能够形成粒径更大和结构更规则的结晶。本专利技术还提供了一种制备方法，其中步骤2)，pH为5.5-6.5，搅拌的速度为50-100转/分钟；沉降时间为大于等于10小时；沉降后，测定上清液OD280nm小于等于0.1时，去除上清液,得到一结结晶。沉降时间优选10-22小时，更优选10-14小时。本专利技术还提供了一种制备方法，所述步骤3)所述打开搅拌器后，搅拌速度50-100转/分钟，pH为6.8-7.2，所述常温纯化水的温度为20-25℃。本专利技术还提供一种制备方法，所述步骤3)一次结晶溶解液的稀释浓度范围为5mg/ml。本专利技术还提供一种制备方法，所述步骤4)所述pH为5.5-6.5，二结结晶罐中二次结晶液沉降大于等于10小时；沉降后，测定上清液OD280nm值小于等于0.1时，则可将上清液排掉；得到二结结晶。本专利技术还提供一种制备方法，所述步骤5)加入常温纯化水的温度为20-25℃；加入纯化水的量使重组人胰岛素样品的浓度至25-60mg/ml。步骤5非常关键，先加入纯化水的原因是避免高浓度酸与样品直接接触，如果高浓度的酸直接接触样品会影响其质量，因此先使用纯化水将重组人胰岛素稀释到一定的浓度后，再接触醋酸，从而保证产品的质量。本专利技术还提供一种制备方法，所述步骤6)使样品中锌离子浓度为0.3-1.6×10—4mg/ml；所述过滤为使用0.22μm的无菌滤芯过滤。本专利技术还提供一种制备方法，所述步骤7)重组人胰岛素二结结晶溶解液的稀释浓度范围为5mg/ml。本专利技术还提供一种制备方法，所述步骤8)，所述pH为5.5-6.5，静置沉淀大于等于10小时，使用0.22μm的无菌滤芯进行过滤。沉降时间优选10-22小时，更优选10-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人胰岛素结晶的制备方法，其特征在于，所述方法由以下步骤组成：1)将含有重组人胰岛素的反向高效层析液，加入锌盐溶液，使每OD280nm的重组人胰岛素中含有锌离子的浓度为10‑55mg/ml,加入低温纯化水，当胰岛素溶液浓度稀释到0.5‑6mg/ml时，搅拌；2)向步骤1)中胰岛素溶液加入3‑5M的氨水进行调沉，直到pH为5.5‑7.5之间时，停止搅拌，得到一次结晶液；将一次结晶液转移至一结结晶罐中静置沉降，沉降后，测定上清液OD280nm小于等于0.2时，排除上清液,得到一结结晶；3)将一结结晶转移到二结调沉罐中，向二结调沉罐中加入1‑3M醋酸进行溶解，搅拌，待一结结晶完全溶解后停止添加醋酸和搅拌，然后向罐中补入常温纯化水，使其稀释浓度为3‑18mg/ml；4)继续搅拌，待溶液搅拌均匀后进行调沉，向罐中加入3‑5M氨水调节溶液pH值至5.5‑7.5，停止搅拌，观察晶体，待晶体形成后，得到二次结晶液；将二次结晶液转移至二结结晶罐中静置沉降，沉降后，测定上清液OD280nm值小于等于0.2时，将上清液排掉；得到二结结晶；5)向二结结晶罐中加入常温纯化水,搅拌，加入1‑3M醋酸，待结晶完全溶解后停止添加醋酸和搅拌；6)向步骤5)的二结结晶罐中补加锌盐溶液，使其锌离子浓度为0.3‑1.6×10—4mg/ml，搅拌均匀后，经无菌滤芯过滤后，转移至已经灭菌的三结调沉罐中；7)向三结调沉罐中加入常温注射用水，稀释浓度范围为3‑18mg/ml，搅拌；8)向步骤7)的三结调沉灌中加入3‑5M氨水溶液调节溶液pH值，当溶液pH值调至5.5‑7.5后，观察晶体，待晶体形成后，得到三次结晶液；将三次结晶液转移至三结结晶罐中，静置沉降，过滤，得到重组人胰岛素结晶。...

【技术特征摘要】
1.一种重组人胰岛素结晶的制备方法，其特征在于，所述方法由以下步骤组成：
1)将含有重组人胰岛素的反向高效层析液，加入锌盐溶液，使每OD280nm的重组人胰
岛素中含有锌离子的浓度为10-55mg/ml,加入低温纯化水，当胰岛素溶液浓度稀释到
0.5-6mg/ml时，搅拌；
2)向步骤1)中胰岛素溶液加入3-5M的氨水进行调沉，直到pH为5.5-7.5之间时，
停止搅拌，得到一次结晶液；将一次结晶液转移至一结结晶罐中静置沉降，沉降后，测
定上清液OD280nm小于等于0.2时，排除上清液,得到一结结晶；
3)将一结结晶转移到二结调沉罐中，向二结调沉罐中加入1-3M醋酸进行溶解，搅
拌，待一结结晶完全溶解后停止添加醋酸和搅拌，然后向罐中补入常温纯化水，使其稀
释浓度为3-18mg/ml；
4)继续搅拌，待溶液搅拌均匀后进行调沉，向罐中加入3-5M氨水调节溶液pH值至
5.5-7.5，停止搅拌，观察晶体，待晶体形成后，得到二次结晶液；将二次结晶液转移至
二结结晶罐中静置沉降，沉降后，测定上清液OD280nm值小于等于0.2时，将上清液排掉；
得到二结结晶；
5)向二结结晶罐中加入常温纯化水,搅拌，加入1-3M醋酸，待结晶完全溶解后停止
添加醋酸和搅拌；
6)向步骤5)的二结结晶罐中补加锌盐溶液，使其锌离子浓度为0.3-1.6×10—4mg/ml，
搅拌均匀后，经无菌滤芯过滤后，转移至已经灭菌的三结调沉罐中；
7)向三结调沉罐中加入常温注射用水，稀释浓度范围为3-18mg/ml，搅拌；
8)向步骤7)的三结调沉灌中加入3-5M氨水溶液调节溶液pH值，当溶液pH值调至
5.5-7.5后，观察晶体，待晶体形成后，得到三次结晶液；将三次结晶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷春生，李树鹏，孟祥成，贾冰，杨旭，常晓慧，
申请(专利权)人：通化东宝药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22