一种胰岛素衍生物的制备方法技术

本发明专利技术针对现有胰岛素衍生物制备过程中使用等电沉淀法所存在的产率不高的问题，提供了一种胰岛素衍生物的制备方法，该方法在胰岛素部分与修饰基团部分的偶联反应完成后，在反应液中加入二价或三价金属离子，从而能将胰岛素衍生物或胰岛素衍生物前体的粗产物从反应液中彻底沉淀出来，残留在上清液中的产物损失量可以降低至对照例（未加金属离子）的7%以下，有些甚至可以降至1%以下或者检测不到，大幅度提高产品收率。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术针对现有胰岛素衍生物制备过程中使用等电沉淀法所存在的产率不高的问题，提供了，该方法在胰岛素部分与修饰基团部分的偶联反应完成后，在反应液中加入二价或三价金属离子，从而能将胰岛素衍生物或胰岛素衍生物前体的粗产物从反应液中彻底沉淀出来，残留在上清液中的产物损失量可以降低至对照例（未加金属离子）的7%以下，有些甚至可以降至1%以下或者检测不到，大幅度提高产品收率。【专利说明】
本专利技术涉及。
技术介绍
糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病。近年来全世界糖尿病的患病率都在增长， 在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加速，糖尿病的患病率更有迅猛增长的 趋势，目前中国糖尿病人数患者已超过1. 14亿，给个人、家庭和社会都带来沉重的负担。 糖尿病患者一般都存在相对或绝对的胰岛素分泌不足，故胰岛素治疗一直被当作 是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。上世纪70年代，人们通过基因工程技术 开发出了重组人胰岛素。后来，为了获得速效或长效等不同作用时间曲线的药物，人们又相 继开发出了一系列的胰岛素类似物和衍生物。其中胰岛素类似物是指增加、删除或改变胰 岛素序列中的一个或多个氨基酸后所得到的胰岛素类产品，胰岛素衍生物是指在胰岛素或 胰岛素类似物的一个或多个位置上引入例如长链脂肪酸、聚乙二醇、烷基链等修饰基团后 所得到的胰岛素类产品。胰岛素衍生物相较于普通人胰岛素具有更长的作用时间，药动学 曲线也更为平稳，更接近生理条件下基础胰岛素的分泌模式。目前已知的胰岛素衍生物有 例如诺和诺德公司开发的地特胰岛素、德谷胰岛素，礼来公司开发的酰化胰岛素、聚乙二醇 化胰岛素等。 在制备方法上，胰岛素类似物由于只涉及胰岛素氨基酸序列上的变化，一般通过 设计核酸序列就可直接通过基因工程获得。但是，胰岛素衍生物需要在胰岛素序列外连接 其他修饰基团，而这部分修饰基团如果不是蛋白质或多肽，通常不能与胰岛素部分一起通 过基因工程获得。因此，现有的胰岛素衍生物的制备方法通常是通过以下步骤来实现：先分 别获得胰岛素部分和修饰基团部分，然后将修饰基团部分与胰岛素部分通过相应的化学反 应进行偶联，得到胰岛素衍生物粗品或胰岛素衍生物前体的粗品。由于该偶联反应的溶液 体积一般较大，反应产物浓度相对较低，因此在偶联反应结束后，通常需要先将反应产物从 反应溶液中沉淀分离出来，甚至干燥后，才能再进行后续的制备步骤，例如进行进一步的纯 化，或是先脱除掉胰岛素和/或修饰基团上的保护基团，再进行纯化等等。 上述制备方法中所述的沉淀分离步骤，在现有技术中通常是利用胰岛素等电沉淀 的原理进行，即，将溶液的pH值调节到胰岛素衍生物的等电点附近，使其沉淀，然后离心收 集沉淀。但是，这种等电沉淀的方法并不能使反应产物沉淀完全，仍会有相当多的胰岛素衍 生物或胰岛素衍生物前体没有沉淀下来而留在上清液中，致使在该步骤中损失很多反应产 物，直接影响最终的产品收率。例如，在专利200480021733. 8的实施例4中，其胰岛素衍生 物的终产率只有12%。
技术实现思路
针对现有技术在制备胰岛素衍生物方法中存在的问题，本专利技术提供了一种胰岛素 衍生物的制备方法，该方法在胰岛素部分与修饰基团部分的偶联反应（以下简称"偶联反 应"）完成后，能够将胰岛素衍生物或胰岛素衍生物前体的粗品从反应液中彻底沉淀出来， 大幅度提_广品收率。 具体的说，本专利技术提供，该制备方法包括在胰岛素 部分与修饰基团部分的偶联反应完成后，在反应液中加入二价或三价金属离子的步骤。 进一步的，本专利技术提供，包括： 1. 分别获得胰岛素衍生物的胰岛素部分和修饰基团部分； 2. 将胰岛素部分与修饰基团部分进行偶联反应； 3. 在步骤2的偶联反应结束后，将反应液的pH值调节至反应产物的等电点附近； 4. 在步骤3的反应液中加入二价或三价金属离子； 5. 收集步骤4获得的沉淀。 不同的胰岛素衍生物由于其胰岛素氨基酸序列的不同或是修饰基团种类的不同， 其合成策略也会有所差别。有些胰岛素衍生物，在偶联反应完成后即可得到胰岛素衍生物 的粗品；而有些胰岛素衍生物，需要在偶联反应之前将胰岛素部分和/或修饰基团部分中 干扰偶联反应的一些基团保护起来，在偶联反应后先得到胰岛素衍生物前体的粗品，然后 再将保护基团脱除掉，得到胰岛素衍生物的粗品。针对这两种不同的合成策略，本专利技术提供 的胰岛素衍生物的制备方法如下(具体流程图参见图1)。 -方面，本专利技术提供，包括： 1. 分别获得胰岛素衍生物的胰岛素部分和修饰基团部分； 2. 将胰岛素部分与修饰基团部分进行偶联反应； 3. 在步骤2的偶联反应结束后，将反应液的pH值调节至反应产物的等电点附近； 4. 在步骤3的反应液中加入二价或三价金属离子； 5. 收集步骤4获得的沉淀，得到胰岛素衍生物粗品。 另一方面，本专利技术提供，包括： 1. 分别获得胰岛素衍生物的胰岛素部分和修饰基团部分，其中所述胰岛素部分和/或 修饰基团部分带有一个或多个保护基团； 2. 将胰岛素部分与修饰基团部分进行偶联反应； 3. 在步骤2的偶联反应结束后，将反应液的pH值调节至反应产物的等电点附近； 4. 在步骤3的反应液中加入二价或三价金属离子； 5. 收集步骤4获得的沉淀； 6. 对步骤5获得的沉淀进行脱保护反应，得到胰岛素衍生物粗品。 优选的，本专利技术的制备方法进一步包括在得到胰岛素衍生物粗品后，对胰岛素衍 生物粗品进行后处理，得到胰岛素衍生物纯品的步骤。 本专利技术所述"胰岛素衍生物"，是指在胰岛素或胰岛素类似物主链的一个或多个位 置上引入修饰基团所形成的胰岛素类产品。 本专利技术所述"胰岛素部分"，是指胰岛素衍生物结构中的胰岛素或胰岛素类似物部 分，其序列可为全部或部分人胰岛素的序列，或是其中氨基酸有增加、删除或改变的全部或 部分胰岛素类似物序列。本专利技术的胰岛素部分可以通过商购获得，也可以采用任何一种本 领域公知的肽/蛋白质合成技术制备，例如固相合成法、基因工程法、DNA重组法等。 本专利技术所述"修饰基团部分"，是指胰岛素衍生物结构中通过化学键连接到胰岛素 部分的基团，其实例包括但不限于脂肪酸链、聚乙二醇链、烷基链等，优选为脂肪酸链。本发 明的修饰基团部分可以通过商购获得，也可以根据修饰基团部分的结构，采用任何一种本 领域公知的技术制备。 本专利技术所述"偶联反应"，是指将胰岛素部分和修饰基团部分通过化学键连接起来 的化学反应。根据胰岛素部分和修饰基团部分中进行化学键连接的反应基团不同，本专利技术 所使用的偶联反应的实例包括但不限于酯化反应、酰化反应、烷基化反应、还原反应等，优 选为酰化反应。 本专利技术所述"二价或三价金属离子"，是指任何具有水溶性的二价或三价金属离 子，包括但不限于 Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Mn 2+、Fe2+、Sr2+、Sn2+、Fe3+、Al 3+。优选为 Cu2+、Co2+、 Ni2+、Zn2+、Fe3+。 在本专利技术中，二价或三价金属离子的加入量以胰岛素部分的使用量为基准。本发 明中所述的二价或三价金属离子的加入量是指二价或三价金属离子与胰岛素部分的摩尔 t匕，该数值可在〇. 1-10:1的范围内，优选〇. 8-8:1，更优选0. 8:1、2:1、4:1、8:1。 本专利技术所述"脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰岛素衍生物的制备方法，所述方法包括在胰岛素部分与修饰基团部分的偶联反应完成后，在反应液中加入二价或三价金属离子的步骤。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董长青，张一宁，孙海瑜，邵东，王晓霞，韩杰丽，张愫华，蔡莲芝，王冲，
申请(专利权)人：甘李药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11