速效胰岛素前体蛋白以及速效胰岛素的制备方法技术

本发明专利技术提供一种门冬胰岛素前体，其氨基酸序列为：Z1(XY)nZ2Z3Z4-B(1-29)-C1C2C3-A(1-21)，其中Z1、X、Z2分别为Asp或Glu；Y为Ala或Gly；n为1~10之间的整数；Z3为Pro、Glu或Asp；Z4、C3分别为Lys或Arg；C1、C2分别为Glu、Asp、Ala或Gly；B(1-29)为门冬胰岛素B链1-29位氨基酸；并且A(1-21)为门冬胰岛素A链1-21位氨基酸。本发明专利技术还提供其编码基因、包含该编码基因的克隆载体或表达载体、转化体，以及利用该速效胰岛素前体蛋白制备速效胰岛素的方法。本发明专利技术的产物表达量高的优势、发酵表达产物纯度高、提取方法简单且收率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种速效胰岛素前体蛋白、其编码基因、包含该编码基因的克隆载体 或表达载体、转化体，以及利用该速效胰岛素前体蛋白制备速效胰岛素的方法。
技术介绍
根据国际糖尿病联盟（InternationalDiabetesFederation，IDF)的最新统计数 据显示，2014年全球糖尿病患者人数已经高达3. 87亿，按目前的增长速度，预测到2035年 全球将有近5. 92亿人患糖尿病。令人担忧的是，中国糖尿病患者更是高达9628. 8万人，是 全球糖尿病患者人数最多的国家。 包括门冬胰岛素、赖脯胰岛素在内的速效胰岛素属于第三代胰岛素，可用于成人I 型糖尿病和II型糖尿病的治疗。门冬胰岛素还可用于儿童、青少年和孕妇及哺乳期妇女糖 尿病的治疗。门冬胰岛素的问世，为拯救糖尿病患者的生命，提高患者的生活质量，带来了 新的曙光。 门冬胰岛素是一种人胰岛素类似物，由A、B两条链组成，与人胰岛素不同的是其B 链第28位脯氨酸替换为天门冬氨酸，利用电荷的排斥作用阻止了胰岛素单体的自我聚集， 从而迅速吸收，因此起效比人胰岛素更快。因此，门冬胰岛素弥补了人胰岛素的不足，使外 源性胰岛素能更好地满足餐时胰岛素需求，包括餐前注射吸收迅速、稳定，达峰时间短，从 而更有效地控制餐后高血糖。目前用重组DNA技术表达胰岛素及胰岛素类似物，主要有三种方法。第一种方法 是利用大肠杆菌表达胞内融合蛋白，通过破壁收获包涵体，再经变复性、酶解方式等处理获 得胰岛素或胰岛素类似物分子。大肠杆菌有生长迅速，培养成本低等优势，但是其缺点也非 常明显：因为大肠杆菌表达的蛋白质大多数以包涵体形式存在，必须经过破壁、包涵体收集 与变复性处理才能得到活性分子，但这些处理方法存在能耗大，工艺繁琐，收率不高等诸多 缺点。 例如，美国专利US20140221606A1公布了一种肠杆菌制备速效胰岛素的方法，该 方案在A链和B链之间添加了一段35个氨基酸残基的C肽，使速效胰岛素前体分子的表达 能力提高至3~5g/L。但是该法通过大肠杆菌表达的速效胰岛素前体分子需经过破壁、包 涵体的收集与洗涤、包涵体溶解、稀释复性、纯化、蛋白酶解等复杂过程才能获得完整的速 效胰岛素分子，再经过一系列层析步骤获得纯品，其制备工艺十分复杂，产品收率不高。 第二种方法是利用酿酒酵母表达胰岛素或胰岛素类似物前体分子，使产物分泌到 胞外培养基中，然后经捕获、酶解和转肽等方法制备胰岛素或胰岛素类似物分子。虽然酿酒 酵母能够将蛋白质分泌到胞外，但也存在一些缺点：如酿酒酵母容易使表达产物发生高度 糖基化，增加了人体发生免疫反应的风险，因此必须在药物纯化过程中增加步骤控制杂质 含量。再者，酿酒酵母还存在生长缓慢，发酵密度不高，启动子能力较弱等问题，这些缺点导 致产物表达量低。 例如，美国专利US5, 618, 913公布了诺和诺德公司制备门冬胰岛素的方法。该方 法以酿酒酵母为表达宿主，利用重组DNA技术生产得到门冬胰岛素前体，再通过转肽等一 系列复杂工艺制备门冬胰岛素。该方法技术壁皇高，特别在宿主菌改造、质粒构建等方面技 术难度大、工艺复杂。由于酿酒酵母自身表达能力较弱，因此产物表达量不高，其工程菌摇 床培养最高为21. 5mg/L，一定程度上增加了药品生产成本。第三种是利用毕赤酵母表达胰岛素或胰岛素类似物前体分子，表达产物同样分泌 到胞外培养基中，经捕获、酶解和转肽等方法制备胰岛素或胰岛素类似物分子。毕赤酵母是 一种非常优秀的表达系统，它可以将蛋白质直接分泌到胞外，还有发酵密度高，产量高等优 势。 但是，目前使用毕赤酵母表达系统生产胰岛素的方案中仍然面临着表达量不高、 产率偏低的挑战，原因涉及编码序列、纯化方法等多方面。因此，仍有必要提供一种能够以 更高效率和得率生产胰岛素的系统和方法。
技术实现思路
本专利技术一方面提供一种门冬胰岛素前体，其氨基酸序列为Zi(XY) nZ2Z3Z4-B(1-29)-(^(^3^(1-21),其中ZpXJA、别为Asp或Glu;Y为Ala或Gly;n为 1 ~ 10 之间的整数；23为Pro、Glu或Asp;Z4、(：3分别为Lys或Arg ;Cρ〇；分别为Glu、Asp、Ala 或Gly;B(1-29)为门冬胰岛素B链1-29位氨基酸；并且A(1-21)为门冬胰岛素A链1-21 位氨基酸。 在一个实施方式中，其中21是6111。在一个实施方式中，其中X是Glu。在一个实 施方式中，其中Y是Ala。在一个实施方式中，其中22是6111。在一个实施方式中，其中23是 Pro。在一个实施方式中，其中(；是6111或Asp。在一个实施方式中，其中(：2是Gly或Ala。 在一个实施方式中，η为3~10之间的整数，或η为5~10之间的整数，或η为7~10之 间的整数。 在一个实施方式中，本专利技术的门冬胰岛素前体的氨基酸序列如SEQIDΝ0. 2所示。 本专利技术另一方面提供一种编码本专利技术所述的门冬胰岛素前体的核苷酸序列。在本专利技术的一 个实施方式中，该核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，其编码SEQIDN0. 2所示的氨基酸序 列。在本专利技术的一些实施方式中，该核苷酸序列是因密码子简并性或宿主偏好性而与SEQ IDNO. 1所示序列具有一个或几个核苷酸差异的核苷酸序列。 本专利技术的另一个方面提供一种含有上述核苷酸序列的克隆载体。在一些实施方式 中，所述克隆载体为重组质粒PPIC9K，重组质粒pPICZαA或重组质粒pPinkaHC。 在本专利技术的一个实施例中，将编码所述的门冬胰岛素前体基因克隆到质粒PPIC9K 中。该重组质粒含有一个Α0Χ1基因启动子序列，其后连有一个来自酿酒酵母α-交配因子 信号肽序列，其后连有一个门冬胰岛素前体基因序列，其后连有一个转录终止子序列，其后 连有一个筛选标记HIS4基因序列，其后连有一个筛选标记卡那霉素抗性基因序列，其后连 有一个Α0Χ1基因的3'末端序列。 在本专利技术的另一个实施例中，将编码所述门冬胰岛素前体基因克隆到质粒 pPICZaΑ中。该重组质粒含有一个Α0Χ1基因启动子序列，其后连有一个来自酿酒酵母 α-交配因子信号肽序列，其后连有一个门冬胰岛素前体基因序列，其后连有一个转录终止 子序列，其后连有一个筛选标记Zeocin抗性基因序列。在本专利技术的另一个实施例中，将编码所述门冬胰岛素前体基因克隆到质粒pPinka-HC中。该重组质粒含有一个A0X1基因启动子序列，其后连有一个来自酿酒酵母 a-交配因子信号肽序列，其后连有一个门冬胰岛素前体基因序列，其后连有一个转录终止 子序列，其后连有一个筛选标记ADE2基因序列。本专利技术的再一方面提供一种包含本专利技术所述克隆载体的表达系统。在一些实施方 式中，一个所述表达系统含有1-12个拷贝的克隆载体。在一些实施方式中，所述表达系统 为毕赤酵母细胞。在一些实施方式中，所述毕赤酵母细胞为毕赤酵母GS115、毕赤酵母X-33 或毕赤酵母PichiaPink。本专利技术的再一方面提供一种制备门冬胰岛素的方法，该方法包括：(a)培养本发 明所述的表达系统；(b)分离、富集得到门冬胰岛素前体；（c)用胰蛋白酶或赖氨酰内切酶 进行转肽，获得门冬胰岛素粗品；以及（d)纯化获得门冬胰岛素。在一些实施方式中，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种门冬胰岛素前体，其氨基酸序列为：Z1(XY)nZ2Z3Z4‑B(1‑29)‑C1C2C3‑A(1‑21)，其中Z1、X、Z2分别为Asp或Glu；Y为Ala或Gly；n为1~10之间的整数；Z3为Pro、Glu或Asp；Z4、C3分别为Lys或Arg；C1、C2分别为Glu、Asp、Ala或Gly；B(1‑29)为门冬胰岛素B链1‑29位氨基酸；并且A(1‑21) 为门冬胰岛素A链1‑21位氨基酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赖红星，肖拥军，马文柱，罗湘冀，夏玉平，祝捷，陈武光，
申请(专利权)人：珠海冀百康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44