本发明专利技术公开了一种单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用。本发明专利技术对具有正常体内活性的重组人促红素蛋白进行聚乙二醇化学修饰，获得具有促进红细胞生成作用以及长效体内活性的单修饰聚乙二醇重组人促红素。本发明专利技术通过对修饰反应的缓冲体系pH值、重组人促红素蛋白浓度，以及重组人促红素蛋白和聚乙二醇的原料比等进行优化，使所制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素的得率高，而多修饰比例低，利于纯化。与修饰前的重组人促红素蛋白相比，本发明专利技术所制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素体内生物比活性高，半衰期有明显延长，能够应用于制备治疗贫血性疾病，尤其是肾性贫血的药物。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种。本专利技术对具有正常体内活性的重组人促红素蛋白进行聚乙二醇化学修饰，获得具有促进红细胞生成作用以及长效体内活性的单修饰聚乙二醇重组人促红素。本专利技术通过对修饰反应的缓冲体系pH值、重组人促红素蛋白浓度，以及重组人促红素蛋白和聚乙二醇的原料比等进行优化，使所制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素的得率高，而多修饰比例低，利于纯化。与修饰前的重组人促红素蛋白相比，本专利技术所制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素体内生物比活性高，半衰期有明显延长，能够应用于制备治疗贫血性疾病，尤其是肾性贫血的药物。【专利说明】
本专利技术涉及重组人促红素蛋白的聚乙二醇修饰物的制备，尤其涉及单修饰聚乙二 醇重组人促红素的制备方法及所制备的单修饰聚乙二醇重组人促红素，本专利技术还涉及所述 单修饰聚乙二醇重组人促红素在制备治疗贫血性疾病，尤其是肾性贫血的药物中的应用， 属于聚乙二醇重组人促红素的制备及应用领域。
技术介绍
肾性疾病是比较严重的慢性疾病，不易完全治愈。中国慢性肾炎的年发病率约为 0.25%，其中有相当部分患者最终会转为肾衰。贫血是肾衰患者的主要并发症，据统计接受 透析治疗的肾衰患者97%会发生贫血。 由于肾性贫血是一种慢性疾病，迀延时间较长，不易完全治愈，因此需要长期使用 治疗贫血药物。重组人促红素类药物是治疗肾性贫血的显著有效药物，无其他药物可以代 替，市场容量非常大。重组EP0是应用基因工程技术从CH0细胞中表达出与天然EP0相近的基 因工程药物，1989年由美国安进公司开发成功。重组EP0成为治疗肾性贫血和外科围手术期 红细胞动员的有效药物，但需要长期使用。 在不显著影响药物体内活性的前提下，开发新型EP0类药物主要是通过蛋白改构 或人工修饰的方式来提高EP0蛋白质的稳定性和延长半衰期，从而减少注射频率和病人痛 苦，提高产品的竞争力和更新换代的水平。蛋白修饰以PEG类修饰剂应用最多。 聚乙二醇(PEG)是由乙二醇单体聚合而成的以羟基结尾的线性或分支状聚醚高分 子化合物，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性，能 改变药物在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少 药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快被消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。PEG是 经美国食品药品管理局(FDA)批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。PEG修 饰蛋白技术由Davis在20世纪70年代首先进行了开拓性研究。1991年，第1种用聚乙二醇修 饰的蛋白药物PEG-腺苷脱氨酶获得FDA批准上市，用于治疗儿童免疫缺陷症，目前已经有多 种PEG修饰蛋白药物上市。 现有的利用PEG对重组人促红素蛋白（EP0)进行化学修饰的方法，不同程度的存在 单取代率低，多取代率高，纯化困难等缺陷，因此亟待开发一种新的单修饰聚乙二醇重组人 促红素的制备方法，以达到提高单取代率的同时降低多取代率。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方 法，该方法利用聚乙二醇对具有正常体内活性的重组人促红素蛋白（EP0)进行修饰，从而获 得具有促进红细胞生成作用及长效体内活性的单修饰聚乙二醇重组人促红素(PEG-EP0)， 而且该方法PEG-EP0的得率高，多修饰比例低，利于纯化； 本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供所制备的单修饰聚乙二醇重组人促红 素在制备治疗贫血性疾病，尤其是肾性贫血的药物中的应用。 为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是： 本专利技术首先公开了一种单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法，包括以下步 骤：向含有重组人促红素蛋白（EP0)的缓冲体系中加入聚乙二醇修饰物，进行聚乙二醇修饰 反应;终止反应，纯化，即得;其中，重组人促红素蛋白与聚乙二醇修饰物的摩尔比为1:1-5; 优选的，所述重组人促红素蛋白与聚乙二醇修饰物的摩尔比为1:2-4,更优选为1:2-3。 本专利技术所述聚乙二醇修饰物为甲氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SBA)。所 述聚乙二醇修饰反应的PEG修饰反应位点主要位于重组人促红素蛋白的N末端a氨基，45位 或52位赖氨酸e氨基中的任意一个位点。 本专利技术制备方法中，所述缓冲体系为100-150禮1(册04 411值为6.0-9.0;优选的， 所述缓冲体系为150mM K2HP〇4,pH值为7.5。所述缓冲体系中，重组人促红素蛋白的浓度为1-5mg/ml，优选为2-4mg/ml，最优选为3mg/ml。所述聚乙二醇修饰反应的条件包括:20-25 °C搅 拌2-4小时;优选为，20-25 °C搅拌2小时;其中，对搅拌的转速没有特殊限制，作为参考，搅拌 转速为 80_130rpm。 本专利技术所述重组人促红素蛋白为人促红素基因经真核细胞表达系统表达获得的； 优选为，人促红素基因经CHO-dhfr-细胞（即：二氢叶酸还原酶缺陷型CH0细胞（中国仓鼠卵 巢细胞））表达获得的。具体的包括，采用重组DNA技术，将带有人促红素基因的重组质粒转 染CHO-dhfr-细胞系，经过细胞培养、分离和高度纯化后制得。重组人促红素蛋白（EP0)的氨 基酸序列为SEQ ID No. 1所示。重组人促红素蛋白的制备方法为本领域所熟知，例如可参考 "张静等.长效红细胞生成素的研究进展和临床应用.中国血液净化，2012,第11卷第9期 ? 519-521 ?，，。本专利技术单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法中，所述终止反应为调整反应液 的pH值为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0;其中，用乙酸调整反应 液的pH值。所述纯化采用离子交换层析，所述离子交换层析的填料为SP Sepharose F.F.或 MacroCap SP中的任意一种，优选为MacroCap SP;所述离子交换层析的步骤包括:依次用平 衡液进行平衡、上样，上样结束后再平衡，用洗涤液进行洗涤，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱 产物，即得;其中，所述平衡液为30mM NaAc，pH值为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0;所述洗涤液为100mM NaCl，30mM NaAc，pH值为2.0-4.5，优选为3.0-4.0， 更优选为3.5-4.0，最优选为4.0;所述洗脱液为175mM NaCl，30mM NaAc，pH值为2.0-4.5，优 选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0;所述再生液为750mM NaCl，30mM NaAc，pH值 为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0。本专利技术单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法，还包括:将纯化后的产物进行 浓缩、换相;其中，所述浓缩为用l〇KDa超滤器进行超滤浓缩;所述换相的换相液包括：10-20mM磷酸钠，40-50mM硫酸钠，pH值为5.5-7.5，优选为5.8-7.0，更优选为6.0-6.5;优选的， 所述换相液为1 〇mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3 %甘露醇，pH值为6.2。本专利技术对单修饰聚乙二醇重组人促红素制备方法中的缓冲体系pH值进行了优化， 结果表明在PH6.0-9.0范围内，pH7.5和pH9.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法，包括以下步骤：向含有重组人促红素蛋白的缓冲体系中加入聚乙二醇修饰物，进行聚乙二醇修饰反应；终止反应，纯化，即得；其特征在于：所述重组人促红素蛋白与聚乙二醇修饰物的摩尔比为1：1‑5。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘海峰，胥国立，庞甲佩，周祥山，解福生，田守生，马立平，王扬，张建岭，史兆松，
申请(专利权)人：昂德生物药业有限公司，东阿阿胶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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