天然人促红细胞生成素类似物制造技术

本发明专利技术涉及一种具有至少一个额外糖基化位点的促红细胞生成素类似物或其变体。本发明专利技术还涉及编码该促红细胞生成素类似物或其变体的DNA序列，以及供该类似物或其变体表达的重组质粒和宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体地说涉及一种具有至少一个额外糖基化位点的促红细胞生成素类似物或其变体。本专利技术还涉及编码所述促红细胞生成素类似物或其变体的DNA序列，以及表达该类似物或其变体的重组质粒和宿主细胞。
技术介绍
促红细胞生成素(erythropoietin, ΕΡ0)是第一个被发现并应用于临床的造血生长因子。早在1906年，Carnot等发现兔失血后会在外周血中产生一种可作用于造血系统以加速红细胞生成的物质，由此提出存在一种体液因子以反馈方式调节血细胞生成。时隔30多年以后此观点才得以证实，这种因子被命名为促红细胞生成素。促红细胞生成素又称血细胞生成素、红细胞 刺激因子，属酸性糖蛋白，是调节前体红细胞增殖、分化以及保持外周血中红细胞浓度处于正常生理范围内的最主要激素。它可与红细胞前体细胞表面的EPO受体结合，促进其血红蛋白的合成使之增殖分化成红细胞，从而调节体内红细胞和血红蛋白的生理平衡。EPO是一个强有力的造血生长因子，体外分析显示在0.05 lU/ml的浓度时即具有剂量依赖效应。EPO可刺激红系祖细胞(BFU-E)和早幼稚红细胞(CFU-E)形成成熟的红细胞集落。EPO除了作用于骨髓巨核前体细胞外，对其他造血细胞均无作用，是迄今认为作用最单一的造血生长因子。当然，对红细胞造血过程的完整调节，除了 EPO外，还需要其他因子的协同作用，包括Mult1-CSF、GM-CSF和IL-1，这些因子促使干细胞变成BFU-E，并联合刺激使红细胞早期增殖，随后才是EPO的增殖作用。1977年，Miyake等从重症再障贫血病人的尿中提取得到了 EPO的纯品，由于起始来源的匮乏，很难得到大量纯品以充分研究其生物学和分子学性质。1984年，科学家们首次以人肾癌细胞的EPO mRNA为模板，经逆转录合成cDNA并在大肠杆菌中得以克隆并表达，在此基础上获得了 EPO的完整基因并在真核细胞中进行高效表达，为深入研究EPO的生物学效应并将之应用于临床奠定了基础。现在国内外已能用基因工程方法生产重组人红细胞生成素(rhEPO)，并用于临床治疗多种红细胞减少症，具有很好的疗效。真核细胞产生的许多细胞表面蛋白和分泌蛋白，都被一个或更多寡糖基团修饰。这种称为糖基化的修饰能强烈影响蛋白质的理化性质，对蛋白质的稳定性、分泌和亚细胞定位也会起重要作用。正确的糖基化有时是生物活性所必需的。某些真核生物的基因在缺乏使蛋白糖基化的细胞过程的细菌(如大肠杆菌)中表达，所回收到的蛋白由于缺乏糖基化而没有或几乎没有活性。糖基化作用出现在多肽骨架的特异位置，通常有两类:0连接糖基化和N连接糖基化。O连接的寡糖连在丝氨酸或苏氨酸残基上，而N连接的寡糖则连接在作为序列Asn-X-Ser/Thr 一部分的天冬酰胺残基上，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。N连接和O连接的寡糖结构及每种类型中存在的糖残基都是不同的。共同存在于两种类型中的一类糖是N-乙酰基神经氨酸(以下简称唾液酸)。唾液酸通常是N连接和O连接寡糖的末端残基，由于它带负电荷，可能会使糖蛋白具有酸性。成熟的EPO由166个氨基酸组成，氨基酸序列参见SEQ ID NO: 1，肽链结构见图1。EPO分子内有两个二硫键，3个N-键糖基化位点和I个O-键糖基化位点，其中两个二硫键在变性EPO复性并折叠成有生物活性构型时是必不可少的。天然人促红细胞生成素和哺乳动物细胞表达的人促红细胞生成素都含有三个N连接寡糖链和一个O连接寡糖链，它们共占蛋白总分子量的40%。N连接糖基化出现在24、38、83位的天冬酰胺残基，而O连接糖基化则出现在 126 位的丝氨酸残基(Lai 等,J.Biol.Chem.261:3116,1986 ；Broundy 等，Arch.Biochem.Biophys.265:329,1988))。已证明寡糖链被末端唾液酸残基修饰。对糖基化促红细胞生成素进行酶处理而脱除唾液酸残基后，导致体内活性丧失，但不影响体外活性(Lowy等，Naturel85:102,1960 ；Goldwasser 等，J.Biol.Chem.249:4202,1974)。这一现象曾被解释为无唾液酸促红细胞生成素由于与肝无唾液酸糖蛋白结合蛋白相互作用而从循环中迅速清除(Morrell 等，J.Bi0.Chem.243:155,1968 出riggs等Am.J.Physiol.227:1385，1974 ；AshwelI,Methods Enzymo1.50:287,1978)。因此促红细胞生成素只有在被唾液酸酸化从而避免被肝结合时才具有体内生物活性。在促红细胞生成素的寡糖中，其作用还不十分确定。已证明，部分脱糖基化的促红细胞生成素与糖基化形式相比，体内活性大大降低，但保留了体外活性(Dordal等，Endocrinologyl 16:2293,1985)。但另一项研究则表明，如果使作为糖基化位点的天冬酰胺或丝氨酸残基发生突变，从而单独或共同脱除N连接或O连接的寡糖链，则会使在哺乳动物细胞中产生的突变蛋白的体外活性急剧下降(Dube等，J.Biol.Chem.263:17516，1988)。糖蛋白如促红细胞生成素，可以用诸如等电聚焦(IEF)等技术分离成不同带 电形式。粗制及部分纯化的促红细胞生成素制备物的IEF研究已有多方报道(Lukosky等，J.Biochem.50:909,1972 ；Shelton 等，Biochem.Med.12:45,1975 ；Fuhr 等，Biochem.Biophys.Res.Comm.98:930,1981)。在Miyake等人所讨论的从人尿纯化人促红细胞生成素中，通过羟基磷灰石色谱法得到的两个促红细胞生成素组分。这两个组分被定名为I1、IIIA。随后对II和III A进行的碳水化合物分析表明，组分II的唾液酸含量比组分III A高。进一步研究还表明，一个位点的糖基化程度很大程度上取决于其周围氨基酸的组成(Kasturi 等，Biochem.J.323:415，1997 ；Elliott 等，JBC.279:16854，2004)，因此，改变N-糖基化位点附近氨基酸组成会在很大程度上影响糖基化的程度。增加促红细胞生成素碳水化合物的数目，并因此而增加每个促红细胞生成素分子的唾液酸数目，可以产生一些优越的性质，例如溶解度提高、更耐受蛋白水解作用、免疫原性下降、血清半衰期延长、生物活性提高。本专利技术通过突变天然EPO序列中的若干个氨基酸残基增加N-糖基化位点数而提高了 EPO类似物的性能。
技术实现思路
本专利技术涉及一种具有促红细胞生成素活性的天然人促红细胞生成素类似物或其变体，该类似物包括至少一个额外N-糖基化位点，其位点范围位于人促红细胞生成素氨基酸序列的1-9，28-32，40-55，86-92，112-133，162-166位，以及该变体在该类似物的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸的缺失、替换或添加，且具有该类似物等同的活性。在一优选的实施方案中，额外N-糖基化位点位于人促红细胞生成素氨基酸序列的1-6，28-32，87-90位。在另一优选的实施方案中，额外N-糖基化位点的数为1-3个。在另一优选的实施方案中，本专利技术的类似物在天然人促红细胞生成素氨基酸序列的2、3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有促红细胞生成素活性的天然人促红细胞生成素类似物，该类似物包括1个额外N?糖基化位点，其中在天然人促红细胞生成素氨基酸序列的第3位置换上了天冬酰胺，第4位置换上了苯丙氨酸，第5位置换上了丝氨酸；即[Asn3Phe4Ser5]EPO；所述的额外N?糖基化位点是氨基酸序列第3位的天冬酰胺。

【技术特征摘要】
1.一种具有促红细胞生成素活性的天然人促红细胞生成素类似物，该类似物包括I个额外N-糖基化位点，其中在天然人促红细胞生成素氨基酸序列的第3位置换上了天冬酰胺，第4位置换上了苯丙氨酸，第5位置换上了丝氨酸；即[Asn3Phe4Ser5JEPO ;所述的额外N-糖基化位点是氨基酸序列第3位的天冬酰胺。2.一种具有促红细胞生成素活性的天然人促红细胞生成素类似物，该类似物包括I个额外N-糖基化位点，其中在天然人促红细胞生成素氨基酸序列的第2位置换上了缬氨酸，第3位置换上了天冬酰胺，第4位置换上了苯丙氨酸，第5位置换上了丝氨酸；SP[Val2Asn3Phe4Ser5IEPO ;所述的额外N-糖基化位点是氨基酸序列第3位的天冬酰胺。3.—种...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄竞，耿建玲，张杰，侯绪凤，赵会林，陆军，苏冬梅，胡金东，
申请(专利权)人：沈阳三生制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：