在本发明专利技术中，记述了用于纯化促红细胞生成素的方法，其包括至少一个应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤。该方法包括下列步骤：ｉ）即在促红细胞生成素与含有羟磷灰石的固定相结合的条件下，将含有钙离子的溶液中的促红细胞生成素与用含有钙离子的溶液平衡的含有羟磷灰石的固定相接触，ｉｉ）将含有比前述溶液较少钙离子的溶液通过来自ｉ）的含有羟磷灰石的固定相，促红细胞生成素未从含有羟磷灰石的固定相中分离，和ｉｉｉ）将含有低于０．５ｍＭ钙离子的另一溶液通过来自ｉｉ）的含有羟磷灰石的固定相，由此将促红细胞生成素从含有羟磷灰石的固定相中分离。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】促红细胞生成素的纯化本文记述了使用羟磷灰石层析(hydroxyapatite chromatography)纯化促红细胞生成素(EPO)的方法。另外描述了用于去除宿主细胞蛋白质的方法和用于改变EPO组合物的同工型分布的方法。
技术介绍
促红细胞生成素(EPO)是一种刺激红细胞产生的人糖蛋白。其作用和治疗应用例如在 EP 0 148 605、EP 0 205 564、EP 0 209 539 和 EP 0 411 678，以及在 Huang, S. L.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, Lai，P. H.等人，J.Biol· Chem. 261(1986)3116-3121 和 Sasaki, H.等人，J. Biol. Chem. 262(1987) 12059-12076 中详细描述。EPO仅以非常低的浓度存在于健康人血浆中。从患有再生障碍性贫血患者的尿中分离人 EPO 是已知的(Miyake, T.等人，J. Biol. Chem. 252 (1977) 5558-5564)。描述了一种七步法，其包括离子交换层析、乙醇沉淀、凝胶过滤和吸附层析。EP 0 148 605和EP 0 205 564 记述了在 CHO 细胞中生产重组人 ΕΡ0。Nobuo, I.等人，J. Biochem. 107 (1990) 352-359 描述了用于纯化重组生产的EPO的方法。用于生产和纯化促红细胞生成素的另外方法是已知的，尤其在下列文献中描述EP 0 148 605、EP 0 205 564、EP 0 255 231, EP 0 830 376、EPO 267 678、EP 0 228 452、EP 1 127 063、EP 0 209 539、EP 0 358 463、EPl 010 758、 EP 0 820 468、EP 0 984 062、EP 0 640 619、EP 0 428 267、EPl 037 921 和 Lai， P. H.等 A, J.Biol. Chem. 261(1986)3116-3121 ；Broudy, V. C.等人，Arch. Biochem. Biophys. 265(1988)329-336 ；Zou, Z.等人，Journal of Chrom. 16 (1998) 263-264 ； Inoue, N.等人，Biol. Pharm. Bull. 17 (1994) 180-184 ;Qian，R. L.等人，Blood 68(1) (1986)258-262、Krystal, G.等人，Blood 67(1) (1986)71-79 ；Lange, R. D.等人，Blood CellslO (2-3) (1984)305-314 ；Sasaki, R.等人，Methods Enzymo 1. 147(1987)328-340 ； Ben Ghanem, A.等)κ, Prep. Biochem. 24(1994) 127-142 ；Cifuentes, Α.等)κ, J. Chrom. A 830(1999)453-463 ；和 Gokana，Α.等人，J. Chromat. A 791(1997) 109-118。EP 1 394 179记述了用于生产不含动物蛋白的促红细胞生成素的方法。EP O 986 644的主题是通过用病毒启动子进行内源基因活化而生产促红细胞生成素。EP 1 428 878 中记述了用于生产重组糖蛋白、特别是促红细胞生成素的方法。EP 1 492 878中记述了用于生产所需特性的促红细胞生成素糖原同工型的方法。专利技术概述重组促红细胞生成素的生成和纯化需要若干步骤，特别是层析步骤。本专利技术的第一方面是生产促红细胞生成素的方法，包括至少一个应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤，且包括下列步骤i)将含有0. 5mM至20mM钙离子浓度的含促红细胞生成素溶液与含有羟磷灰石的固定相接触，所述固定相已用含有0. 5mM至20mM相同钙离子浓度的溶液平衡，ii)将含有低于0. 5mM钙离子浓度的溶液通过含有羟磷灰石的固定相，和iii)将含有低于0. 5mM钙离子浓度的溶液通过含有羟磷灰石的固定相，由此生产促红细胞生成素。在一个实施方案中，与i)中含促红细胞生成素的溶液相比，所生产的促红细胞生成素不含脱氧-EPO类和脱氮-EPO类。在进一步的实施方案中，除了应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤之外，该方法还包括至少一个另外的层析步骤。在进一步的实施方案中， 所有层析步骤均以不同的层析原理为基础，其中各层析原理在该方法中仅使用一次。在进一步的实施方案中，该一个或多个层析原理选自亲和层析、疏水相互作用层析、反相层析、 凝胶渗透层析、阳离子交换层析和/或阴离子交换层析。在进一步的实施方案中，层析步骤的顺序为亲和层析、疏水相互作用层析、在含有羟磷灰石的固定相上的层析、任选的反相层析和阴离子交换层析。在一个实施方案中，除层析步骤之外，根据本专利技术的方法还包括任选的中间步骤，例如盐沉淀、浓缩、渗滤、超滤、透析和/或乙醇沉淀。本专利技术的一方面是已用根据本专利技术的方法获得的促红细胞生成素组合物。本专利技术的又一方面是用于从促红细胞生成素制品中去除中国仓鼠卵巢(CHO)细胞蛋白质的方法，包括根据本专利技术的应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤，其中含有促红细胞生成素的馏分的收集受^Onm处的光吸收控制，以15mAU至75mAU的吸收开始，并在峰最大值通过200mAU至40mAU的吸收后终止。在一个实施方案中，含有羟磷灰石的固定相是纯的结晶羟磷灰石。在另一个实施方案中，步骤ii)和/或iii)中用于层析的溶液含有约5mM磷酸盐离子浓度，在另一个实施方案中，为5mM磷酸钠或磷酸钾。本专利技术的另一方面是用于制备促红细胞生成素组合物的方法，所述组合物是促红细胞生成素同工型的混合物，所述促红细胞生成素同工型中每个促红细胞生成素分子的唾液酸残基数大于6且小于17，并且四触角糖基形式三触角糖基形式双触角糖基形式的比率范围为83 14 2至74 21 6。在一个实施方案中，该比率在该范围内是线性的。因此，本专利技术的另一方面是促红细胞生成素组合物，其是促红细胞生成素同工型的混合物，所述促红细胞生成素同工型中每个促红细胞生成素分子的唾液酸残基数大于6且小于17，并且四触角糖基形式三触角糖基形式双触角糖基形式的比率范围为 83 14 2至74 21 6。在一个实施方案中，所述比率在该范围内是线性的。在一个实施方案中，该促红细胞生成素组合物的四触角糖基形式具有一个重复单元的四触角糖基形式具有两个重复单元的四触角糖基形式三触角糖基形式具有一个重复单元的三触角糖基形式双触角糖基形式的比率范围为 43 28 12 8 6 2至45 21 7 14 7 6。在一个实施方案中，所述比率在该范围内是线性的。因此，本专利技术的又一方面是促红细胞生成素组合物，其四触角糖基形式具有一个重复单元的四触角糖基形式具有两个重复单元的四触角糖基形式三触角糖基形式具有一个重复单元的三触角糖基形式双触角糖基形式的比率范围为 43 28 12 8 6本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．用于纯化促红细胞生成素的方法，其包括：ａ）提供含有ｉ）促红细胞生成素和ｉｉ）第一钙离子浓度的溶液，ｂ）提供包含含有羟磷灰石的固定相的层析柱，ｃ）将含有第二钙离子浓度的溶液施加到ｂ）的柱子上，ｄ）将ａ）的溶液施加到ｃ）中所得的柱子上，ｅ）将含有第三钙离子浓度的溶液施加到ｄ）中所得的柱子上，和ｆ）通过将含有第四钙离子浓度的溶液施加到ｅ）中所得的柱子上而回收纯化的促红细胞生成素，其中所述第一钙离子浓度和第二钙离子浓度是相等的，所述第三钙离子浓度和第四钙离子浓度是相等的，且低于所述第一钙离子浓度和第二钙离子浓度。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·施马尔兹，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH
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