一种激活促红细胞生成素基因表达的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种激活促红细胞生成素基因表达的方法，为利用TALE技术在目的细胞中激活促红细胞生成素基因的表达，包括以下步骤：1）在促红细胞生成素基因启动子上游寻找TALE靶点序列，设计特异性识别TALE靶点序列的，由TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块；2）靶点识别模块编码序列的构建；3）通过酶切连接的方法，将步骤2）制备的所述靶点识别模块编码序列与骨架载体连接，获得重组质粒；4）将重组质粒转化目的细胞并培养。本发明专利技术利用TALE技术在自体骨髓间充质干细胞中激活促红细胞生成素基因的表达，为基因治疗提供了新的细胞来源，并能在组织工程和细胞治疗中发挥重要的作用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生物
，具体涉及，为利用TALE技术在目的细胞中激活促红细胞生成素基因的表达，包括以下步骤：1）在促红细胞生成素基因启动子上游寻找TALE靶点序列，设计特异性识别TALE靶点序列的，由TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块；2）靶点识别模块编码序列的构建；3）通过酶切连接的方法，将步骤2）制备的所述靶点识别模块编码序列与骨架载体连接，获得重组质粒；4）将重组质粒转化目的细胞并培养。本专利技术利用TALE技术在自体骨髓间充质干细胞中激活促红细胞生成素基因的表达，为基因治疗提供了新的细胞来源，并能在组织工程和细胞治疗中发挥重要的作用。【专利说明】
本专利技术涉及生物
，具体涉及。
技术介绍
TALE (Transcription activator-effectors)技术是一种薪新的分子生物学工具。研究学者发现，来自植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的一种TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有着恒定的对应关系。利用TALE的序列模块，可组装成特异结合任何DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的(LiT,Huang S, Jiang W Z,et al.TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TALeffectors and FokI DNAcleavage domain.Nucleic Acids Res.2011;39(I):359-372.)。目前 TALE 技术主要有两种应用:l)TALEN(transcription activator-like (TAL)effector nucleases)的基因敲除；2) TALEA (transcription activator-like (TAL)effector activator)的转录激活。TALEA的转录激活是将识别特异DNA序列的TALE与转录激活区域VP64 (VP64Activation Domain)融合,可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA，将TALEA质粒转入细胞后，表达的融合蛋白结合启动子附近的特异DNA序列，并通过VP64激活区域与PolII结合，激活目标基因的转录，从而提高了内源目标基因的表达(Zhang F, Cong L, Lodato S, et al.Efficient construction ofsequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.NatBiotechnol.2011; 29⑵:149-153.)。目前，TALEA已经成功运用到哺乳动物细胞中，Miller等利用人工设计的TALEA在人HEK293细胞中能够激活内源性NTF3基因的转录并使其表达水平增加了 20 倍(Miller JC, Tan S, Qiao G, et al.A TALE nuclease architecture forefficient genome editing.Nat Biotechnol.2011; 29 (2): 143-148.)。因为 TALE 技术无基因、细胞、物种限制，实验设计简单，毒性低、脱靶情况少等优点，TALE技术在酵母、动植物细胞的基因组定点修饰、遗传疾病的基因疗法及基因的功能研究等方面都有广阔的应用前旦o骨髓间充质干细胞(MSC)是骨髓中除造血干细胞以外的一类具有高度可塑性的细胞群体，是骨髓基质细胞的前体细胞。在特定的诱导条件下具有向骨、软骨、肌腱、心肌、神经、脂肪等基质细胞分化的能力(George J, Goldstein E, Abashidze A, etal.Erythropoietin promotes endothelial progenitor cell proliferative andadhesive properties in a PI3-kinase-dependent manner.Cardiovasc Res.2005 ；68(2):299-306.)。由于骨髓间充值干细胞具有采集方便、易于在体外培养、诱导和扩增以及免疫原性低等特性，被认为在细胞治疗、基因治疗、组织工程等领域具有广阔的应用前景。近年来的许多动物实验和临床研究均证明，以干细胞为基础的细胞移植在心血管疾病中的治疗效果显著。但目前研究发现，移植细胞在心肌微环境下发生凋亡可能是影响心功能改善效率的重要原因之一(Lange C，Schroeder J, Stute N，et al.High-potential humanmesenchymal stem cells.Stem Cells Dev.2005;14(I):70-80.)。促红细胞生成素(erythropoietin, EP0)是促进红细胞分化和生存的主要细胞因子，是细胞生长因子超家族成员之一。有实验表明，心血管组织可以表达EP0，表明EPO可能起到保护心肌细胞的作用，外源性EPO具有很好的治疗心血管疾病的作用(Van derMeer P, Lipsic E, Henning RH, et al.Erythropoietin improves left ventricularfunction and coronary flow in an experimental model of ischemia-reperfusioninjury.Eur J Heart Fail.2004; 6 (7): 853)。已有文献报道，EPO 治疗联合 MSC 较单独的MSC移植能进一步改善缺血下肢功能恢复和组织重塑，这可能与体内EPO增加，EPO能抑制MSC凋亡，促进MSC分泌VEGF以及EPO本身血管生成能力有关(Zhang D, ZhangF, Zhang Y, and et al.Erythropoietin enhances the angiogenic potency ofautologous bone marrow stromal cells in a rat model of myocardial infarction.Cardiology.2007; 108 (4): 228-36.)。然而传统的EPO注射易出现红细胞增多，多次注射有导致纯红细胞再生障碍等不良反应(Rossert J, Pure Red Cell Aplasia GlobalScientific Advisory Board (GSAB) ? Erythropoietin-1nduced, antibody-mediated purered cell aplasia.Eur J Clin Invest.2005;35:95-99.)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用TALE技术在人自体骨髓间充质干细胞(MSC)中激活EPO (促红细胞生成素)基因表达的方法。本专利技术选用人EPO基因和人骨髓间充质干细胞作为靶基因和靶细胞，利用TALE技术在MSC细胞中激活EPO基因的表达，为基因治疗提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种激活促红细胞生成素基因表达的方法，其特征在于，为利用TALE技术在目的细胞中激活促红细胞生成素基因的表达，包括以下步骤：1）在促红细胞生成素基因启动子上游寻找TALE靶点序列，设计特异性识别TALE靶点序列的由TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块；2）靶点识别模块编码序列的构建：构建编码步骤1）所述靶点识别模块的双链DNA；3）通过酶切连接的方法，将步骤2）制备的所述靶点识别模块编码序列与骨架载体连接，获得重组质粒；4）重组质粒转染目的细胞，及目的细胞的培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱向莹，许可，翁仕强，曹跃琼，金杨晟，
申请(专利权)人：上海吉凯基因化学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：