纯化促红细胞生成素的方法技术

本发明专利技术涉及制备促红细胞生成素的方法，其中将产生促红细胞生成素的真核细胞的包含促红细胞生成素的培养上清进行以下步骤：ａ）移除细胞组分；和ｂ）以规定的顺序通过以下色谱步骤处理ａ）的产物：ｉ）反相色谱；ｉｉ）阴离子交换色谱；ｉｉｉ）羟基磷灰石色谱。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及，其中将产生促红细胞生成素的真核细胞 的包含促红细胞生成素的培养上清以特定方式连续进行特定的色谱纯化步骤。促红细胞生成素，简称ΕΡ0，是刺激骨髓中红细胞形成的糖蛋白。EPO主要在肾中 形成，从此处借助血液循环到达其靶。在肾机能不全的情况下，受损的肾产生不足的EPO或 者根本不产生ΕΡ0，这导致骨髓干细胞几乎不产生红细胞。这种所谓的肾性贫血可以通过施 用生理量的EPO来治疗，该EPO刺激骨髓中红细胞的形成。用于施用的EPO可以从人尿中 获得或者通过基因工程方法产生。由于EPO仅在人体中痕量产生，所以从天然来源分离EPO 作为治疗应用实际上不可能。因此，基因工程方法是大量产生该物质的仅有的经济选择。自从1984年鉴定了人促红细胞生成素基因，促红细胞生成素的重组生产已经成 为可能。从二十世纪九十年代初开始，已经开发了各种含有人促红细胞生成素的药物，该人 促红细胞生成素通过基因工程路线在真核细胞，主要在CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中 产生。重组人促红细胞生成素的生产在例如EP-A-0148605和EP-A-205564中有描述。促红细胞生成素的重组生产通常在CHO宿主细胞中完成。尽管这些宿主细胞曾经 在加入胎牛血清并且有时也加入牛胰岛素的培养基中生长，但是目前它们通常在无血清和 无蛋白培养基中生长。这种方式能够完全避免牛蛋白、牛病毒、牛DNA或者其他不期望的牛 源物质污染的风险。用于生长真核细胞的合适无血清和无蛋白培养基可由各种生产商提 供,例如MAM-PF2培养基，其例如由Bioconc印t，Allschwil, Switzerland出售；或者DMEM 禾口 DMENU12 培养基，其由例如 Invitrogen/Gibco，Eggenstein, Germany 出售。各种促红细胞生成素的色谱纯化方法在现有技术中也有描述。EP-A-0228452描述 了从液体中纯化生物活性促红细胞生成素的方法，该方法包括阴离子交换色谱和反相色谱 的色谱步骤。EP-A_(^67678描述了无血清培养基中产生的促红细胞生成素的纯化，其通过连续 进行的渗析，离子交换色谱，制备型反相HPLC和凝胶过滤色谱进行。此处，凝胶过滤色谱步 骤能够由离子交换色谱替代。同样地，提出于(第一)离子交换色谱前在Blue trisacryl 柱上进行染料亲和色谱。EP-A-0830376描述了，其中将来自培养上清的EPO在 色谱纯化的第一步中进行染料亲和色谱。然后在第二步中，进行疏水载体上的色谱，之后进 行羟基磷灰石色谱。然后进行反相HPLC，其后进行最后的色谱步骤阴离子交换色谱。EP-A-1127063描述了包括以下步骤的促红细胞生成素纯化方法示差沉淀，疏水 相互作用色谱，渗滤，阴离子交换色谱，阳离子交换色谱和尺寸排阻色谱。每个纯化步骤以 EP-A-1127063中提到的顺序进行。在该方法的一个变体中，纯化包括如下步骤示差沉淀， 疏水相互作用色谱，渗滤，阴离子交换色谱，阳离子交换色谱，进一步的渗滤和尺寸排阻色 谱。在每种情况下，该方法在第一步中进行沉淀，之后进行离心。同样地，强制进行凝胶过 滤以完成色谱纯化。国际申请W0-A-03/045996描述了 EPO的纯化方法，该方法包括阴离子交换色谱和 其后的反相色谱以及进一步阴离子交换色谱。第二阴离子交换色谱之后是利用凝胶过滤介4质的尺寸排阻色谱。促红细胞生成素的纯化也是EP-A-0428267的主题。此处，色谱在Q琼脂糖⑴ Sepharose)柱上进行，在某些情况下，随后进行反相色谱和凝胶过滤。W02005/121173提供了纯化通过发酵方法产生的EPO的方法。该方法基于至少4 种不同色谱分离方法的色谱纯化。第一阴离子交换色谱之后是亲和色谱、疏水相互作用色 谱和羟基磷灰石色谱，这3个最后提及的色谱类型的顺序是按需要进行的。最后，再次使用 阴离子交换色谱。因此，当使用这些方法来生产满足欧洲药典规定的纯度标准的EPO时，需要至少5 个色谱步骤。合适的EPO标准例如小于IOOppm的来源于宿主细胞的异源蛋白含量，小于 100pg/mg EPO的来自宿主细胞的DNA含量，以及最后满足关于同种型组成标准的组成(Ph. Eur. ；01/2002 :1316)。本专利技术的目的是描述另一种纯化方法。本专利技术意图获得这样的EPO终产物，其满 足欧洲药典(Ph. Eur. ；01/2002 :1316)和/或关于含有重组促红细胞生成素的生物仿制药 物产品的指导(Guidance on Biosimilar MedicinalProducts Containing Recombinant Erythropoietins) (EMEA/CHMP/94256/2005)所定义的标准并且其可以在技术上以合适的 方式使用，特别是发酵的EPO的生产。特别地，本专利技术的目的在于本专利技术的方法从经济观点 而言优于现有技术方法。而且，本专利技术的目的在于本专利技术的方法使用具有很少的纯化性能 损耗的较少色谱纯化步骤并且省却特定的、技术复杂的色谱步骤，如亲和色谱。通过来解决技术问题，其中将产生促红细胞生成素的 真核细胞的包含促红细胞生成素的培养上清进行以下步骤a)移除细胞组分；和b)以规定的顺序通过以下色谱步骤处理a)的产物i)反相色谱；ii)阴离子交换色谱；iii)羟基磷灰石色谱。在所述方法的优选实施方案中，在步骤a)之前以及步骤a)至b iii)之间不使用 其他色谱方法。另外，还优选在步骤b iii)之后也不使用其他色谱方法。本专利技术的方法提供促红细胞生成素产物的增殖(propagation)，该产物满足欧洲 药典(Ph. Eur. ；01/2002 :1316)和/或关于含有重组促红细胞生成素的生物仿制药物产品 的指导(EMEA/CHMP/94256/20(^)所定义的标准。在本文中，如此制备的促红细胞生成素满 足以下标准小于IOOppm的来源于宿主细胞的异源蛋白含量，小于100pg/mg EPO的来自宿 主细胞的DNA含量，以及最后满足关于同种型组成标准的组成(Ph. Eur. ；01/2002 :1316)。 而且，获得的EPO产品在生物测定中具有至少150000IE/mg的生物活性。而且，IEF中的条 带结构和糖基化模式相应于商业Erypo 产品。事实上，在纯化来自哺乳动物细胞培养物的生物技术EPO生产的发酵上清的方法 中，将自细胞组分纯化的发酵上清以规定顺序通过以下色谱步骤处理i)反相色谱(RP色谱)ii)阴离子交换色谱(DEAE色谱)iii)羟基磷灰石色谱(HA色谱)以极其有利但令人惊讶的方式来解决提出的问题。根据存在的现有技术(特别 是TO2005/121173，根据该国际申请，若可能则应该避免RP色谱)寻求解决所定义问题的 本领域技术人员不会成功预期减少纯化满足标准的EPO所需要的色谱步骤的数量是可能 的。结果是需要较少的设备，人力和材料并且也节约时间，但最重要的是关于病毒污染的最 大安全性。此外，本专利技术的方法允许使用较少的辅助剂和仅可接受的有机溶剂，例如乙醇或 2-丙醇。这个目标以适合的方式通过按照规定顺序使用上述色谱步骤来实现。本专利技术的方法所用的色谱原理从文献已知并且对本领域技术人员已知(Meyer本文档来自技高网...

【技术保护点】
纯化促红细胞生成素的方法，其中将产生促红细胞生成素的真核细胞的包含促红细胞生成素的培养上清进行以下步骤：　　ａ）移除细胞组分；和　　ｂ）以规定的顺序通过以下色谱步骤处理ａ）的产物　　ｉ）反相色谱；　　ｉｉ）阴离子交换色谱；　　ｉｉｉ）羟基磷灰石色谱。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】DE 2008-6-4 102008002209.81.纯化促红细胞生成素的方法，其中将产生促红细胞生成素的真核细胞的包含促红细 胞生成素的培养上清进行以下步骤a)移除细胞组分；和b)以规定的顺序通过以下色谱步骤处理a)的产物i)反相色谱； )阴离子交换色谱；iii)羟基磷灰石色谱。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤a)之前以及步骤a)至biii)之间 没有使用其他色谱方法。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述产生促红细胞生成素的真核细胞 是哺乳动物细胞，优选人细胞，并且特别优选表达人重组促红细胞生成素的中国仓鼠卵巢 细胞。4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其特征在于将产品质量与参考材 料不相应的那些洗出液部分额外地进行另外的i)的反相色谱和/或ii)的阴离子交换色 谱和/或iii)的羟基磷灰石色谱。5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其特征在于在步骤i)、ii)和/或 iii)之后进行超滤。6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其特征在于步骤a)包括微滤和随 后的超滤。7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述反相色谱在作为 固定相的载体材料上进行，所述载体材料选自C1-至C8-改性的硅胶、基于聚苯乙烯/ 二乙 烯基苯的疏水聚合载体以及硅胶或聚合物基底上的疏水整体相材料组成的组中，并且其中 将水性链烷醇溶液用作洗脱液。8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：W维南德，FR孔茨，D赖歇特，W奥伊尔，R汉科，C比尔，M辛霍费尔沃夫拉，D朔波尔柯尼希，L法贝尔，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：DE