本发明专利技术涉及用于生产高度糖基化形式（相对于天然ＥＰＯ中３个Ｎ连接的糖基化，总共５个Ｎ连接的糖基化）的促红细胞生成素的重组方法。所增加的糖基化位点将产生更多数目的糖链，以及比人ＥＰＯ更高的唾液酸含量，这将使得该重组分子的半衰期更长。本发明专利技术还涉及包含编码高度糖基化形式的促红细胞生成素的核酸序列表达盒的构建，以及在宿主细胞中的稳定表达。本发明专利技术还涉及用于纯化促红细胞生成蛋白的优化方法。本发明专利技术的重组ＥＰＯ及其盐和功能衍生物，可以包含药物组合物中用于增加血细胞比容的活性成分，因此可用于治疗贫血症以及恢复患者的健康状况和生活质量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及用于生产高度糖基化形式(相对于天然EPO中3个N 连接的糖基化，总共5个N连接的糖基化)的促红细胞生成素的重组 方法。所增加的糖基化位点将产生更多数目的糖链，以及比人EPO更 高的唾液酸含量，这将使得该重组分子的半衰期更长。本专利技术还涉及表达盒的构建，该表达盒包含编码高度糖基化形式 的促红细胞生成素的核酸序列，以及涉及在宿主细胞中的稳定表达。本专利技术更涉及用于纯化促红细胞生成蛋白(erythropoiesis stimulating protein) 6勺^f尤4匕方法。本专利技术的重组EPO及其盐和功能衍生物，可以包含药物组合物 中用于增加血细胞比容的活性成分，因此可用于治疗贫血症以及恢复 患者的健康状况和生活质量。专利技术背景促红细胞生成素(Erythr叩oietin, EPO)是一种糖蛋白激素，是红细 胞生成或者将身体红细胞总量维持在最适宜水平的主要调节因子。作 为对組织氧合作用减少的反馈，EPO在肾脏中的合成增加。分泌的激 素结合到骨髓中红细胞前体表面的特异性受体上，从而调节红细胞前 体的存活、增殖、分化以及最终增加血细胞比容(红细胞体积与全血体 积的比率)。自从10多年前，引入重组人EPO(rHuEPO)后，它已成为治疗慢 性肾衰竭(CRF)相关的贫血症的治疗标准，在治疗贫血症、恢复能量 水平以及提高患者的健康状况和生活质量方面非常有效，还被批准用 于癌症、HIV感染相关的贫血症，以及用于外科手术以减少异源输血的需要。用rHuEPO治疗通常推荐的是通过皮下注射或静脉注射，每周2-3 次。对于CRF患者，治疗的持续时间是患者的一生，或者直到成功进 行了肾移植，恢复了肾脏功能，包括促红细胞生成素激素产生的功能。 对于癌症患者，通常会贯穿整个化学治疗过程，只要贫血症持续，就 需要进行rHuEPO治疗。然而，商业化可得到的蛋白疗法例如EPO的 生物利用度，由于其血浆半衰期较短、对蛋白酶降解的敏感性而受到 限制。因此，本专利技术的目的是提供一种重组方法，用于生产分开的和分 离的促红细胞生成素同等型，该同等型具有确定的唾液S臾含量、更长 的半衰期且因此增加的生物活性。专利技术概述本专利技术涉及用于生产高度糖基化形式(相对于天然EPO中3个N 连接的糖基化，总共5个N连接的糖基化)的促红细胞生成素的重组 方法。所增加的糖基化位点将产生更多数目的糖链，以及比人EPO更 高的唾液酸含量，这将使得该重组分子的半衰期更长。本专利技术还提供的是新颖必需的生物学功能和掺入本专利技术DNA序 列的环状质粒DNA载体，以及用所述载体稳定转化或转染的宿主生 物体。本专利技术相对提供的是用于生产有用多肽的新方法，该新方法包括 在促使携带DNA序列的外源载体大规模表达的条件下，培养生长这 些已转化或者已转染的宿主；从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜片 段中分离出所需多肽。本专利技术的一个方面，涉及包含有编码高度糖基化形式的促红细胞 生成素的核酸序列的表达盒的构建。与未修饰的EPO和常规的EPO-PEG缀合物相比，本专利技术所述蛋 白的循环半衰期和血浆保留时间增加，清除时间减少，临床体内活性增加。本专利技术的重组EPO及其盐和功能性衍生物，可以包含药物组合 物中用于增加血细胞比容值的活性成分，因此可用于治疗贫血症以及 恢复患者的健康状况和生活质量。对于本领域的技术人员来说，结合下文为实施本专利技术而提供优选 实施方案的专利技术详述，本专利技术的许多方面和优势将会是显而易见的。附图和序列详细描述SEQ ID No. 1:编码新的4足红细胞生成蛋白(novel Erythropoetin stimulating protein,简写nesp, Nesp, NESP)的核香酸序列。SEQ ID No.2:编码新的4足红细胞生成蛋白的核苦酸序列的密码 子优化形式。SEQ ID No.3: NESP或者达依泊汀a (Darbepoietin alfa)的氨基酸序列。附图说明图1:编码新的促红细胞生成蛋白的DNA核苦酸序列的未优化 形式和密码子优化形式的配对序列比对图。图2:促红细胞生成蛋白的从头合成的优化cDNA序列 (AVCIP-Nesp-Opt)与促红细胞生成蛋白已确立的和进一步优化的序列 (合成Nesp-Opt)的序列比对图。图3:促红细胞生成蛋白的从头合成的cDNA序列(AVCIP-Nesp) 与促红细胞生成蛋白的已确立序列(合成Nesp)的序列比对图。图4:载体和插入片段的限制酶切消化图。图5: AVCIP-Nesp、 AVCIP-Nesp國Opt和pcDNA3.1D/V5國His的 限制酶切消化片段的凝胶纯化图。图6: AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp假定克隆和 AVCIPpcDNA3.1 D/V5-His/Nesp-Opt假定克隆的限制酶切消化分析 图。图7:用/人内切开AVCIP-Nesp cDNA和AVCIPNesp-Opt cDNA 的酶，对AVCIPpcDNA3.1 D/V5-His/Nesp克隆和AVCEPpcDNA3.1 D/V5-His/Nesp-Opt克隆的限制酶切消化分析。图8: AVCIP-Nesp-Opt 4号cDNA克隆(合成Nesp-Opt)与已确立的Nesp-Opt基因序列的序列比对图。图9: AVCIP-Nesp 9号cDNA克隆(合成Nesp)与已确立的Nesp基因序列的序列比对图。图10: AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp构建体图谱。 图11: AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt构建体图谱。 图12: pcDNA3.1/NESP(天然序列)。 图13: pcDNA3.1/NESP(优化序列)。图14 :用兔抗人促红细胞生成素抗体(2ug/ml)对用 pcDNA3.1/NESP (天然序列)或者pcDNA3.1/NESP (优化序列)和 Aranesp頂转染的CHO Kl细胞系的总细胞裂解物的蛋白质印迹分析。图15:稳定细胞系开发的流程图。图16:挑选用于开发表达达依泊汀a(Darbepoetinalfa)的稳定 CHOK1细胞系的集落图快照。专利技术详述本专利技术提供用于生产促红细胞生成素同等型的可选择的新的重 组方法。根据本专利技术获得的特殊促红细胞生成素同等型及其性质，随 原料的来源不同可能有所不同。在一个优选的实施方案中，本专利技术涉 及一种用于生产促红细胞生成素同等型的可选择的新的重组方法，该 同等型在5个位置(Ala 30 Asn; His 32 Thr; Pro 87 Val; Trp 88 Asn和 Pro 90 Thr)上不同于重组人促红细胞生成素(recombinant human Erythropoietin, rHuEPO)和天然的人EPO。本文使用的术语"促红细胞生成素同等型(erythropoietin isoform)" 是指有单一等电点(pl)，以及有相同氨基酸序列的促红细胞生成素制备物。本文所用的术语"促红细胞生成素(erythropoietin)",包括天然 产生的促红细胞生成素、尿源的人促红细胞生成素以及非天然产生的 多肽，所述非天然产生的多肽具有促使骨髓细胞增加网织红细胞和红 细胞产生的体内生物学性质，还具有天然产生的促红细胞生成素本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于制备有体内生物活性的促红细胞生成蛋白的方法，该方法包括以下步骤： （ａ）让已用选自以下的分离的ＤＮＡ序列转化或者转染的宿主细胞在适当的营养条件下生长：（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１和ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示的ＤＮＡ序列，（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３所示的蛋白编码序列，和（ｉｉｉ）在严谨条件下，能与（ｉ）和（ｉｉ）所述的ＤＮＡ序列或者它们的互补链杂交的ＤＮＡ序列；和 （ｂ）从中分离出所述促红细胞生成素产品。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：V莫拉瓦拉帕特尔，
申请(专利权)人：阿维斯塔金格兰技术有限公司，
类型：发明
国别省市：IN[印度]
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