使用改良的肠杆菌科菌株制备L氨基酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种重组的分泌L‑氨基酸的肠杆菌科微生物，其包含功能性地连接编码膜蛋白的多核苷酸的具有启动子活性的DNA片段，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段包含SEQ ID NO:8。

Preparation of l-amino acids by improved Enterobacteriaceae strains

【技术实现步骤摘要】
使用改良的肠杆菌科菌株制备L氨基酸的方法专利
本专利技术涉及使用肠杆菌科的重组微生物发酵制备L-氨基酸如L苏氨酸的方法，所述重组微生物包含功能性地连接编码膜蛋白或氨基酸转运蛋白的多核苷酸的具有启动子活性的特定DNA片段，以及本专利技术涉及各种(respective)微生物。专利技术背景L-氨基酸，特别是L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸用于人类医学和制药工业、食品工业和动物营养。已知L-氨基酸通过发酵肠杆菌科菌株、特别是大肠杆菌(E.coli)和粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)制备。由于极其重要性，不断尝试改良制备过程。方法学的改良可涉及关于发酵技术的措施，例如搅拌和供氧，或者营养培养基的组成，例如使用的糖的选择或者发酵期间的糖浓度，或者产物形式的改进，例如通过离子交换层析法，或微生物自身固有性能特性。在野生型菌株中，严格的调节机制阻止产生超过所述菌株所需的代谢产物如氨基酸及阻止释放到培养基中。因此，从制造商的观点来看，氨基酸过量产生菌株的构建需要克服这些代谢调控。诱变、选择和突变体选择的方法用于除去所述控制机制和改良这些微生物的性能特性。这样获得对抗代谢物例如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)具有抗性的菌株，或者对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型及产生L-氨基酸例如L-苏氨酸的菌株。例如，产生L异亮氨酸的菌株的特征在于对异亮氨酸类似物硫异亮氨酸(thiaisoleucine)的抗性。多年来，重组DNA方法同样用于通过扩增例如单个氨基酸生物合成基因或改变特殊基因的性质并研究对生产的影响而以特定方式改良肠杆菌科的L-氨基酸生产菌株。关于大肠杆菌和沙门氏菌的细胞生物学和分子生物学的比较信息可见于Neidhardt(ed):EscherichiacoliandSalmonella,CellularandMolecularBiology,2ndedition,ASMPress,Washington,D.C.,USA,(1996)。关于L-苏氨酸代谢和产生的综述由Debabov(AdvancesinBiochemicalEngineeringVol.79,113-136(2003))和RiepingandHermann(MicrobiologyMonographs,Vol.5,71-92,ISSN1862-5576(印刷)和1862-5584(在线),SpringerVerlagBerlin/Heidelberg(2007))出版发行。先前已发现具有氨基酸输出蛋白活性的蛋白质(rhtC基因的基因产物)催化氨基酸L-苏氨酸的输出。因此，rhtC的过表达通过介导对苏氨酸的抗性导致这种代谢物的外部积累(Zakataevaetal.,FEBSLetters452(3):228-32(1999),Kruseetal.,AppliedMicrobiologicalBiotechnology59(2-3):205-10(2002))。氨基酸输出蛋白属于氨基酸输出蛋白Rht家族(Aleshinetal.,TrendsinBiochemicalScience24(4):133-5(1999))，并且假定其具有苏氨酸/质子逆向转运蛋白的功能。编码大肠杆菌氨基酸输出蛋白的野生型rhtC基因和上游区域的核苷酸序列通常可在国家医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库中获得，登记号为NC000913(区域：4005780-4006400及上游)。欧洲专利申请EP1013765A1描述了rhtC基因过表达对埃希氏菌属(Escherichia)菌株生产和制备不同氨基酸如L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸的有益作用，在这种情况中所述过表达是通过增加rhtC基因的拷贝数或者通过将rhtC基因与在埃希氏菌属中有效的启动子结合而实现。本专利技术人最近发现取决于表达系统，膜蛋白例如氨基酸转运蛋白及特别是氨基酸输出蛋白如rhtC的高表达水平，可导致希望的氨基酸的生产水平降低。特别地和对于氨基酸产量而言，强启动子系统不适合在相应的氨基酸生产系统中表达上述膜蛋白。因此，对于膜蛋白，特别重要的是在发酵期间当高浓度的氨基酸积累在发酵液中时调节(组成型或诱导型)表达的正确水平。EP1013765描述了通过扩增rhtC基因的拷贝数制备L-苏氨酸抗性细菌的方法，以及L-苏氨酸滴度相对于其中rhtC基因未增强的菌株是增加的。然而，没有描述在生产商业相关量的氨基酸的埃希氏菌属菌株中过表达的影响。基因表达尤其受基因5'区域内的启动子区域控制。启动子通过转录因子和RNA聚合酶的相互作用启动转录。结果，启动子含有许多保守序列基序，这些基序可以基于其共有序列确定(Fournieretal.,AntimicrobialAgentsandChemotherapy39(6):1365-1368(1995)；Chapon,EMBOJournal1:369-374(1982)；Smithetal.,JournalofBacteriologicalChemistry257:9043-9048(1982))。如下普通细菌启动子元件基于在最佳研究的细菌模型生物大肠杆菌中借助于sigma-70因子转录的基因的共有序列进行分类(Rosenbergetal.,Nature272:414-423(1978)；HawleyandMcClure,NucleicAcidsResearch11(8):2237-2255(1983))：-35区域(转录起始点上游35个碱基对的序列)，共有序列：5'-TTGACA-3'，-10区域(这个序列可以在转录起始点上游的大约10个碱基对发现)，也称作Pribnowbox，共有序列：5'-TATAAT-3'。RNA聚合酶的sigma因子与这两个区域结合，然后所述聚合酶诱导下游基因转录。强和弱启动子的“共有序列”可以通过比较各个启动子的DNA序列得到。启动子元件彼此及与转录起始位点的位置也是重要的。共有序列中从-10区至转录起始位点的距离为5-7个碱基对，其中-10和-35区由16-18个碱基对分隔。然而，启动子与共有序列的相似性不一定在埃希氏菌属的每个菌株中提供高表达水平，控制表达水平的其它调节机制可能比优化的共有序列更重要。鉴于上述关于膜蛋白表达水平的发现，仍然需要提供用于调节膜蛋白、特别是氨基酸输出蛋白如rhtC的表达水平的改良方法和工具，以进一步改良通过产生L氨基酸的肠杆菌科微生物发酵制备L-氨基酸，特别是L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-组氨酸。
技术实现思路
本专利技术涉及一种重组的分泌L-氨基酸的肠杆菌科微生物，其包含功能性地连接编码膜蛋白的多核苷酸的具有启动子活性的DNA片段，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段包含SEQIDNO：8。本专利技术进一步提供了一种利用上述微生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组的分泌L-氨基酸的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)微生物，其包含具有启动子活性的DNA片段，所述DNA片段功能性地连接编码膜蛋白的多核苷酸，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段包含SEQ ID NO:8。/n

【技术特征摘要】
20180809 EP 18188250.7;20180809 US 16/100,039;20181.一种重组的分泌L-氨基酸的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)微生物，其包含具有启动子活性的DNA片段，所述DNA片段功能性地连接编码膜蛋白的多核苷酸，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段包含SEQIDNO:8。


2.权利要求1的微生物，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段在3'末端连接携带核糖体结合位点的第二DNA片段。


3.权利要求1的微生物，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段在3'末端连接具有SEQIDNO:9的位置174-204的核苷酸序列的第二DNA片段。


4.权利要求1的微生物，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段在3'末端连接具有SEQIDNO:9的位置174-204的核苷酸序列的第二DNA片段，所述第二DNA片段在其3'末端连接编码所述膜蛋白的多核苷酸。


5.前述任一项权利要求的微生物，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段在5'末端连接具有SEQIDNO:9的位置1-138的核苷酸序列的DNA片段。


6.前述任一项权利要求的微生物，特征在于所述膜蛋白是具有氨基酸转运蛋白活性的蛋白质。


7.权利要求6的微生物，特征在于所述具有氨基酸转运蛋白活性的蛋白质是具有氨基酸输出蛋白活性的蛋白质。


8.权利要求7...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·里平，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE