发酵生产L-赖氨酸的方法技术

本发明专利技术提供了使用具有分泌L‑赖氨酸的能力的物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的细菌发酵生产L‑赖氨酸的新方法，在所述细菌的染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的多核苷酸，其中多肽的氨基酸序列特定位置处的氨基酸被不同的蛋白原氨基酸取代。

Production of L-lysine by fermentation

【技术实现步骤摘要】
发酵生产L-赖氨酸的方法L-赖氨酸用于人类医学、制药工业、食品工业、以及特别用于动物营养。L-赖氨酸是通过物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)菌株的发酵产生的。由于经济上的重要性，正在不断进行改善生产方法的工作。改善可能涉及发酵技术，例如搅拌和供应氧气，或涉及营养培养基的组合物，例如发酵过程中的糖浓度，或涉及将发酵液通过例如干燥和造粒发酵液或离子交换色谱加工成合适的产品形式，或者可能涉及微生物本身的固有性能特性。用于改善这些微生物的性能特性的方法是那些诱变、选择和筛选突变体的方法。以这种方式获得的菌株对于抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷的，并产生L-赖氨酸。熟知的抗代谢物是L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(参见例如Tosakaetal.:AgriculturalandBiologicalChemistry42(4),745-752,(1978))。多年来，通过修饰(即增强或减弱)单个涉及L-赖氨酸生物合成的基因并研究对L-赖氨酸生产的影响，重组DNA技术的方法同样用于改善物种谷氨酸棒杆菌的产L-赖氨酸菌株。已经分别公开了各种细菌或物种谷氨酸棒杆菌菌株的染色体的核苷酸序列，以及它们的分析。该信息可在公共可访问的数据库中获得，并可用于菌株开发目的。一个这样的数据库是NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation，U.S.NationalLibraryofMedicine8600RockvillePike，BethesdaMD，20894USA)的GenBank数据库。在针对生物体测序的染色体注释过程期间，通过向数据库提供信息的提供者，向鉴定的结构例如基因或编码序列提供称为locus_tag的唯一标识符。谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析由IkedaandNakagawa(AppliedMicrobiologyandBiotechnology62,99-109(2003))描述并在EP1108790中描述。该信息可在NCBI以登录号NC_003450获得。在以登录号NC_003450公开的染色体序列中，locus_tagNCgl0458标识编码转录抗终止蛋白NusG的核苷酸序列。多肽的氨基酸序列可在标识符NP_599720.1下获得。在EP1108790中，编码序列公开于序列532(参见GenBank登录号AX120616)。Kalinowski等人独立地描述了谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析(JournalofBiotechnology104(1-3)，5-25(2003))。该信息可在NCBI以登录号NC_006958获得。Locus_tagCGTRNA_RS02440标识编码转录终止/抗终止蛋白NusG的核苷酸序列。old_locus_tag名称cg0562也在本领域中使用。多肽的氨基酸序列可在标识符WP_011013678下获得。该多肽的氨基酸序列也可在登录号CAF19189下获得，其中其被描述为转录抗终止蛋白NusG。locus_tagNCgl0458和CGTRNA_RS02440的核苷酸序列是相同的。抗终止是一种控制细菌中RNA聚合酶的转录的机制。在抗终止期间，RNA聚合酶的活性被修饰，使得其越过转录终止子读取位于所述终止子下游的基因。遗传学、基因组学、蛋白质组学和信息学百科全书(Springer,Dordrecht,2008；DOI:https://doi.org/10.1007/978-1-4020-6754-9_978)指出：“抗终止允许RNA聚合酶忽略转录终止指令例如细菌的rho，并因此继续通过终止信号。”细菌遗传学中已知的经典抗终止子是大肠杆菌(Escherichiacoli)噬菌体λ(lambda)的抗终止子蛋白N。所述抗终止子蛋白N允许噬菌体基因的表达，从而允许病毒启动其裂解期。噬菌体λ的蛋白N与修饰RNA聚合酶活性所需的称为Nus(N(噬菌体λ蛋白)利用物质)因子的宿主蛋白形成复合体，以这种方式，其不再响应终止子。这些Nus因子之一分别是蛋白质或多肽NusG。大肠杆菌的EcoCyc数据库(SRIInternational(StanfordResearchInstitute),MenloPark,US,CA)在登录号EG10667下总结了由nusG基因编码的多肽：转录终止因子NusG是某些种类的Rho依赖性终止以及转录抗终止所需的。关于转录终止和抗终止的进一步资料可以在微生物学、分子生物学或遗传学的教科书中找到，例如在JocelynE.Krebs,ElliotS.GoldsteinandStephenT.Kilpatrick的教科书Lewin’sGenesXII(Jones&BartlettLearning,BurlingtonMA(US),2018)中。Barreiro等人(AppliedandEnvironmentalMicrobiology67(5)，2183-2190,2001)报道了包含nusG基因的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)六基因簇的组构和转录分析。Barreiro等人称编码的多肽为抗终止子蛋白NusG。编码NusG多肽的基因称为nusG。有关谷氨酸棒杆菌中转录信号的信息(例如nusG基因(old_locus_tagcg0562)的启动子的(一个或多个)-10区或(一个或多个)转录起始位点)可以在Pfeifer-Sancar等人(BMCGenomics14：888(2013))或Barreiro等人中找到。本领域将NusG多肽描述为转录抗终止子。因此，NusG多肽分别具有参与转录的多肽的活性或转录因子的活性。本专利技术的目标是提供通过物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的细菌发酵生产L-赖氨酸的新措施。为了实现上述目标，本专利技术提供了使用具有分泌L-赖氨酸能力的物种谷氨酸棒杆菌的细菌发酵生产L-赖氨酸的新方法，在所述谷氨酸棒杆菌的染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的多核苷酸，其中多肽的氨基酸序列位置210处的氨基酸含有不同于天冬酰胺的任何蛋白原氨基酸，优选天冬氨酸或谷氨酸代替天冬酰胺。本专利技术进一步提供了从发酵液中制备含有所述L-赖氨酸的产物的方法。因此，本专利技术提供以下内容：一种发酵生产L-赖氨酸的方法，包含以下步骤：a)提供一种具有分泌L-赖氨酸能力的物种谷氨酸棒杆菌的细菌，在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的多核苷酸，并且所述多肽包含SEQIDNO：2的氨基酸序列，其中位置210处的氨基酸天冬酰胺被不同的蛋白原氨基酸取代，优选被谷氨酸或天冬氨酸取代，特别优选被天冬氨酸取代，b)在合适的条件下的合适的培养基中培养所述细菌，以及c)在所述培养基中积累L-赖氨酸以形成含L-赖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵生产L-赖氨酸的方法，包含以下步骤：/na)提供一种具有分泌L-赖氨酸的能力的物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的细菌，在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的多核苷酸，并且所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中位置210处的氨基酸天冬酰胺被不同的蛋白原氨基酸取代，/nb)在合适的条件下在合适的培养基中培养所述细菌，以及/nc)在所述培养基中积累所述L-赖氨酸以形成含L-赖氨酸的发酵液。/n

【技术特征摘要】
20180712 EP 18183133.0;20180905 EP 18192624.71.一种发酵生产L-赖氨酸的方法，包含以下步骤：
a)提供一种具有分泌L-赖氨酸的能力的物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的细菌，在其染色体中含有编码具有转录因子活性的多肽的多核苷酸，并且所述多肽包含SEQIDNO：2的氨基酸序列，其中位置210处的氨基酸天冬酰胺被不同的蛋白原氨基酸取代，
b)在合适的条件下在合适的培养基中培养所述细菌，以及
c)在所述培养基中积累所述L-赖氨酸以形成含L-赖氨酸的发酵液。


2.权利要求1的方法，其中在所提供的细菌中，在SEQIDNO：2的氨基酸序列位置210处的所述氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。


3.权利要求2的方法，其中在所提供的细菌中，在SEQIDNO：2的氨基酸序列位置210处的所述氨基酸是天冬氨酸。


4.权利要求3的方法，其中在所提供的细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQIDNO：1的位置375至1328的核苷酸序列，位置1002至1004的核碱基是gac或gat。


5.权利要求3的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·贝克尔，F·施耐德，G·蒂尔巴赫，K·福斯，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE