一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用大肠杆菌发酵生产L‑茶氨酸的方法，属于生物工程技术领域，所述方法是在发酵培养过程中，将发酵罐中的大肠杆菌培养至OD为20‑30时，向发酵罐中添加D~木糖使D~木糖的浓度为5~20g/L并调温至28~35℃诱导4~5h；然后以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40‑80%的乙胺溶液，继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃、溶氧10~40%的条件下发酵培养20‑30h，合成L‑茶氨酸。发酵周期短、产酸效率高、菌体密度高；底物转化率高；而且工艺简单，环境污染低，降低了L~茶氨酸的生产成本，有利于工业化生产的推广和应用。

A method of producing L-theanine by E.coli fermentation

【技术实现步骤摘要】
一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法
本专利技术属于生物工程
，具体地，涉及一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法。。
技术介绍
L~茶氨酸(L~theanine)，是存在于茶叶中的一种氨基酸。其可促进大脑表皮α波的形成而让人感觉放松，可降低人体内5~羟色胺的浓度起到降血压的作用，并在肿瘤治疗和神经保护等方面也有广泛的应用。美国食品与药物管理局(FDA)已确认L~茶氨酸是一种公认安全(GRAS)的产品。γ~谷氨酰基转肽酶(γ~glutamyltranspeptidase，GGT，EC2.3.2.2)是谷胱甘肽代谢途径中的关键酶，是由大、小亚基组成的异源二聚体，其催化的反应有2种类型：一种是催化γ~谷氨酰基化合物的水解反应，另外一种是催化γ~谷氨酰基化合物中的γ~谷氨酰基转移到氨基酸或多肽等物质上的转肽反应。Suzuki等首先报道了E.coliK~12SH642来源的GGT能够催化L~谷氨酰胺与乙胺生成L~茶氨酸。该反应无需对反应物进行保护和脱保护，反应过程不需要ATP的参与，因此利用GGT来催化合成L~茶氨酸已成为目前研究的热点。王丽鸳等利用大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET32a~GGT催化L~谷氨酰胺与乙胺合成L~茶氨酸，该工程菌在pH9.5，32~37℃下能催化合成的产量为20.9g/L。帅玉英等利用BacillussubtilisSK11．004来源的GGT在pH10.0，37℃下，以20mmol/LL~谷氨酰胺为底物，摩尔转化率可达95%。ShrutiBindal等利用BacilluslicheniformisER~15来源的rBLGGT，80mmol/LL~谷氨酰胺为初始底物，经3次补加后可催化合成L~茶氨酸35.2g/L。
技术实现思路
为了解决现有技术中的不足，本专利技术的目的在于提供一种利用大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的方法，所述方法是在发酵阶段加入D-木糖低温诱导，然后加入乙胺，在一定的发酵条件下进行产酸发酵，周期较短，L-产氨酸的产量和得率较高。为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法，所述方法是在发酵培养过程中，将发酵罐中的大肠杆菌培养至OD为20-30时，向发酵罐中添加D~木糖使D~木糖的浓度为5~20g/L并调温至28~35℃诱导4~5h；然后以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40-80%的乙胺溶液，继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃、溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h，合成L-茶氨酸。作为对上述方案的进一步优化，所述方法包括菌种活化、种子培养和发酵培养；所述种子培养是将活化菌种接种到种子培养基中进行培养，培养条件为：温度35~40℃、摇床转速200rmp、培养至OD为10-20；所述发酵培养是将菌种以5-15%的接种量接种至发酵培养基后进行产酸发酵，培养条件为：初始发酵温度35~40℃，空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%，发酵pH值控制在6.5-7.5之间，摇床转速200rmp。作为对上述方案的更进一步优化，所述种子培养基的配方为：葡萄糖20~30g/L，K2HPO410-20g/L,MgSO4·7H2O0.5~3.0g/L，KH2PO410-20g/L，酵母粉0.5-5.0g/L，(NH4)2SO45.0~10.0g/L，微量元素5~10.0mL/L，pH6.7。作为对上述方案的更进一步优化，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖20~30g/L，K2HPO410-20g/L，MgSO4·7H2O0.5~3.0g/L，酵母粉0.5-3.0g/L，(NH4)2SO45.0~10.0g/L，微量元素5~10.0mL/L，初始pH7.0。有益效果：1、本专利技术所述方法采用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸，该菌株发酵为好氧发酵，菌体生长快；在产酸发酵阶段，首先采用D-木糖低温诱导，然后加入乙胺提供L-茶氨酸的合成原料，茶氨酸合成酶具有高度专一性，只能催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸；然后在整个发酵系统的调控下，使得L-茶氨酸的产量显著增高。2、采用本专利技术所述发酵方法，发酵周期短，菌体密度大。L~茶氨酸的产量和得率高、糖酸转化率高的优点，代谢副产物较少，生产成本降低，方便提取。具体实施方式一种利用大肠杆菌菌株发酵法生产L~茶氨酸的方法。具体步骤如下：1、大肠杆菌菌株发酵法生产L~茶氨酸斜面培养：大肠杆菌原始菌株经斜面活化，生化培养箱37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于完全培养基（LB）上，挑取单个菌落分别接种到斜面上，生化培养箱35~40℃培养12-20h。种子培养：挑取单菌落接种到种子培养基中，培养条件：温度35~40℃、摇床转速200rmp，培养OD值长到10.0~20.0。发酵培养：接种到发酵培养基中，接种量：5~~15%，培养条件：初始发酵温度35-40℃，空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%，发酵pH值控制在6.5-7.5之间，摇床转速200rmp，当培养OD值达到20~30，添加D~木糖使得D~木糖的浓度为5~20g/L，并降温至28~35℃诱导4~5h后，开始以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40-80%的乙胺溶液，继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃，溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h，发酵结束后得含有L-茶氨酸的发酵液。所述种子培养基，其各组分的含量为：葡萄糖20~30g/L，K2HPO410~20g/L,MgSO4·7H2O0.5~3.0g/L，KH2PO410~20g/L，酵母粉0.5~5.0g/L，(NH4)2SO45~10.0g/L，微量元素5~10.0mL/L，pH6.7。所述发酵培养基，其各组分的含量为：葡萄糖20~30g/L，K2HPO410~20g/L,MgSO4·7H2O0.5~3.0g/L，酵母粉0.5~3.0g/L，(NH4)2SO45~10.0g/L，微量元素5~10.0mL/L，初始pH7.0。2、从大肠杆菌发酵液中提取L~茶氨酸的方法将上述所得发酵液加热到40~60℃，用2mo1/L盐酸调节pH至2~5范围内，加入无水亚硫酸氢钠，过30nm陶瓷膜微滤，纯化水清洗2~3次，得到上清液；取上清液过1000~5000分子量的中空纤维束膜，此时L~茶氨酸回收率为92.3~95.4%。将上清液过强酸性阳离子交换柱，条件为静态吸附：按20%体积比加入阳离子树脂，搅拌吸附1h；动态吸附：按15%体积装柱树脂，流速按2BV/h进料，末期用0.5~1BV水冲柱；收集上清液。将上清液按体积比0.5~1%加入活性炭60℃脱色0.5~2h，过滤除炭。收集得到L~茶氨酸上清液进行真空浓缩，按照下列条件进行：真空度~0.1MPa，旋转速度100~200rpm，温度50℃~80℃浓缩。将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法，其特征在于：所述方法是在发酵培养过程中，将发酵罐中的大肠杆菌培养至OD为20-30时，向发酵罐中添加D~木糖使D~木糖的浓度为5~20g/L并调温至28~35℃诱导4~5h；然后以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40-80%的乙胺溶液，继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃、溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h，合成 L-茶氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法，其特征在于：所述方法是在发酵培养过程中，将发酵罐中的大肠杆菌培养至OD为20-30时，向发酵罐中添加D~木糖使D~木糖的浓度为5~20g/L并调温至28~35℃诱导4~5h；然后以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40-80%的乙胺溶液，继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃、溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h，合成L-茶氨酸。


2.根据权利要求1所述的一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法，其特征在于：所述方法包括菌种活化、种子培养和发酵培养；
所述种子培养是将活化菌种接种到种子培养基中进行培养，培养条件为：温度35~40℃、摇床转速200rmp、培养至OD为10-20；
所述发酵培养是将菌种以5-15%的接种量接种至发酵培养基后进行产酸发酵，培养条件为：初始发酵温度35~40℃，空气流量5~...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹华杰，谢沛，李静，张孟涛，封浪，刘晓东，
申请(专利权)人：河南巨龙生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41