一种缩短莽草酸发酵停滞期并提高产酸水平的方法技术

本发明专利技术涉及一种缩短莽草酸发酵停滞期并提高发酵产酸的方法，属于发酵工程领域。本发明专利技术所使用的菌种为大肠杆菌W3110，发酵前期存在停滞期较长，OD长势较慢的问题，使发酵产酸水平较低（6‑8g/L）和发酵周期较长（40h）。通过向培养基中添加异亮氨酸，工艺优化后，发酵产酸有大幅度提高，且发酵周期明显缩短，为提高生产莽草酸的经济效益提供方向。

【技术实现步骤摘要】
一种缩短莽草酸发酵停滞期并提高产酸水平的方法
本专利技术属于发酵工程
，具体地，涉及一种缩短莽草酸发酵停滞期并提高产酸水平的方法。
技术介绍
莽草酸是被国际卫生组织推荐的唯一一个合成抗H6N1亚型高致病性禽流感的特效药物磷酸奥司米韦的起始原料，目前主要从八角茴香中提取获得。但因为八角茴香原产地奇少且生长周期长，由于原料的制约和提取工艺的繁琐复杂、生产成本较高的原因严重限制了莽草酸的产量。微生物发酵法生产莽草酸是目前发展起来的一种十分经济有效的方法，且成本低、环境污染较小、生产周期短、产品纯度较高等优点成为解决市场需求的有效方法。近年来，大肠杆菌以其基因工程操作和高密度培养技术成熟、遗传学资料丰富、培养周期短、成本较低的优势成为开发高产莽草酸工程菌的首选。但是，基因工程菌大肠杆菌在发酵过程中存在停滞期较长的问题，发酵产酸水平较低，导致发酵周期较长，不利于工业化生产。因此，找到一种缩短迟滞期，提高发酵产酸水平并缩短发酵周期的方法具有重要意义。
技术实现思路
为解决微生物发酵生产莽草酸发酵前期停滞期较长的问题，本专利技术的目的在于提供一种缩短莽草酸发酵停滞期并提高产酸水平的方法，所述方法是在发酵底料中添加1-2g/L的异亮氨酸，同时进行发酵工艺的严格控制，不仅解决了发酵停滞期较长的问题，发酵产酸水平也明显提高，且发酵周期也明显缩短。为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：一种缩短莽草酸发酵停滞期并提高产酸水平的方法，采用如下工艺进行发酵：步骤一、种子培养：将大肠杆菌W3110发酵菌种接种至种子培养基中，37℃培养，pH控制在6.6-6.8，初始条件：200rpm、罐压0.5Mpa、风量0.2m3/h，培养OD至12-18时按照10-20%的接种量进行移种；步骤二、发酵培养：将经种子培养后的发酵菌种接种至发酵培养基中，36℃培养，pH控制在6.6-6.8之间，初始条件：200rpm、罐压0.5Mpa、风量0.4m3/h，溶氧控制在25%-35%，培养OD至15时，添加0.1-0.2mM的IPTG进行诱导，底糖耗至0.5%时开始流加葡萄糖，并维持残糖在0.5%；步骤二所述发酵培养期间，在发酵培养基底料中添加1-2g/L异亮氨酸。进一步地，步骤一所述接种是在经种子培养至OD为15时按照15%的接种量进行接种。进一步地，所述异亮氨酸的添加量为1g/L。进一步地，所述种子培养基的配方为：葡萄糖10-20g/L；酵母粉4-6g/L；蛋白胨4-6g/L；柠檬酸2-4g/L；硫酸镁2-4g/L；磷酸氢二铵：6-8g/L；色氨酸0.3-0.6g/L；酪氨酸0.6-0.8g/L；苯丙氨酸0.6-0.8g/L；硫酸亚铁10-40mg/L；硫酸锰1-10mg/L；氯化钴1-4mg/L；生物素1-4mg/L；VB11-4mg/L。进一步地，所述发酵培养基配方为：葡萄糖20-30g/L；酵母粉6-8g/L；蛋白胨6-8g/L；柠檬酸2-4g/L；硫酸镁2-4g/L；磷酸氢二铵：8-10g/L；色氨酸0.3-0.6g/L；酪氨酸0.6-0.8g/L；苯丙氨酸0.6-0.8g/L；硫酸亚铁10-40mg/L；硫酸锰1-10mg/L；氯化钴1-4mg/L；生物素1-4mg/L；VB11-4mg/L；有益效果：本专利技术与原始工艺相比，发酵产酸水平由原来的6-8g/L提高至20-25g/L，且发酵周期由原来的40h缩短至24h，极大提高了发酵产酸水平，并缩短发酵时间16h，这也有利于提高生产批次降低生产成本，为莽草酸发酵研究提供了基础条件。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例一种缩短莽草酸发酵停滞期并提高产酸水平的方法，包括种子培养和发酵培养，所述种子培养是将大肠杆菌W3110发酵菌种接种至种子培养基中进行得到种子液，培养条件为：37℃，pH6.7，种子培养至OD15左右时，按照15%的接种量进行移种；所述发酵培养是将种子液接种至发酵培养基中进行，培养条件为：36℃，pH6.7，溶氧控制在25％-35%，残糖控制在0.5％，最高罐压控制在1.0Mpa，最高转速控制在550rpm，最高风量控制在1.2m3/h，发酵周期为24h。在底料中添加1g/L异亮氨酸，发酵停滞期为0.5h，发酵培养OD至15左右时，一次性流加0.1mM的IPTG进行诱导。发酵结束后，发酵液中莽草酸浓度可达24g/L。所述种子培养基配方为：葡萄糖20g/L；酵母粉4g/L；蛋白胨4g/L；柠檬酸2g/L；硫酸镁2g/L；磷酸氢二铵：6g/L；色氨酸0.3g/L；酪氨酸0.6g/L；苯丙氨酸0.6g/L；硫酸亚铁10mg/L；硫酸锰5mg/L；氯化钴4mg/L；生物素4mg/L；VB14mg/L。所述发酵培养配方为：葡萄糖20g/L；酵母粉6g/L；蛋白胨6g/L；柠檬酸2g/L；硫酸镁2g/L；磷酸氢二铵：8g/L；色氨酸0.3g/L；酪氨酸0.6g/L；苯丙氨酸0.6g/L；硫酸亚铁10mg/L；硫酸锰5mg/L；氯化钴4mg/L；生物素4mg/L；VB14mg/L。对比例采用大肠杆菌W3110发酵菌种接种种子培养基，所述种子培养基配方为：葡萄糖20g/L；酵母粉4g/L；蛋白胨4g/L；柠檬酸2g/L；硫酸镁2g/L；磷酸氢二铵：6g/L；色氨酸0.3g/L；酪氨酸0.6g/L；苯丙氨酸0.6g/L；硫酸亚铁10mg/L；硫酸锰5mg/L；氯化钴4mg/L；生物素4mg/L；VB14mg/L；培养条件为：36℃，pH6.7，种子培养至OD10左右时，按照10%的接种量进行移种至发酵培养基；所述发酵培养配方为：葡萄糖20g/L；酵母粉6g/L；蛋白胨6g/L；柠檬酸2g/L；硫酸镁2g/L；磷酸氢二铵：8g/L；色氨酸0.3g/L；酪氨酸0.6g/L；苯丙氨酸0.6g/L；硫酸亚铁10mg/L；硫酸锰5mg/L；氯化钴4mg/L；生物素4mg/L；VB14mg/L。培养条件为：36℃，pH6.7，溶氧控制在25%-35％，最高罐压控制在1.0Mpa，最高转速控制在550rpm，最高风量控制在1.2m3/h，残糖控制在0.5％，发酵周期为40h。发酵停滞期为3.5h，培养OD至10左右时，一次性流加0.1mM的IPTG进行诱导。发酵结束后，发酵液中莽草酸浓度为8g/L。通过实施例与对比例对比可知，采用本专利技术所述方法，发酵产酸水平明显提高，发酵周期也大幅度缩短。需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的保护范围，本专利技术的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对本专利技术作出的一些非本质的改进和调整仍属于本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种缩短莽草酸发酵停滞期并提高产酸水平的方法，采用如下工艺进行发酵：/n步骤一、种子培养：将大肠杆菌发酵菌种接种至种子培养基中，37℃培养，pH控制在6.6-6.8，初始条件：200rpm、罐压0.5Mpa、风量0.2m

【技术特征摘要】
1.一种缩短莽草酸发酵停滞期并提高产酸水平的方法，采用如下工艺进行发酵：
步骤一、种子培养：将大肠杆菌发酵菌种接种至种子培养基中，37℃培养，pH控制在6.6-6.8，初始条件：200rpm、罐压0.5Mpa、风量0.2m3/h，培养OD至12-18时按照10-20%的接种量进行移种；
步骤二、发酵培养：将经种子培养后的发酵菌种接种至发酵培养基中，36℃培养，pH控制在6.6-6.8之间，初始条件：200rpm、罐压0.5Mpa、风量0.4m3/h，溶氧控制在25%-35%，培养OD至15时，添加0.1-0.2mM的IPTG进行诱导，底糖耗至0.5%时开始流加葡萄糖，并维持残糖在0.5%；
步骤二所述发酵培养期间，在发酵培养基底料中添加1-2g/L异亮氨酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤一所述接种是在经种子培养至OD为15时按照15%的接种量进行接种。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹华杰，徐倩，李静，
申请(专利权)人：河南巨龙生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41