发酵生产L-瓜氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法和应用技术

本发明专利技术发酵生产L

【技术实现步骤摘要】
发酵生产L
‑
瓜氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及L
‑
瓜氨酸的发酵生产，具体涉及发酵生产L
‑
瓜氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法和应用。

技术介绍

[0002]瓜氨酸是一种中性、非必需、非蛋白质的氨基酸，是尿素循环的中间体，对于维持血氨平衡具有重要的作用。可以用于治疗类风湿关节炎；预防心血管疾病；具有良好的抗氧化作用，通过抗氧化剂的作用来清除人体内的自由基，在一定程度上提高人体免疫力和延缓衰老；还可以提高细胞内环磷酸鸟苷的水平，具有预防男性疾病和提高性功能的作用。
[0003]目前，瓜氨酸的生产方法主要分为四种：第一、从富含瓜氨酸的植物中进行提取，但产量和提取率较低；第二、化学有机合成，在合成过程中产生大量的工业废水和废气，对环境危害较大，且易产生D型旋光对映体，不利于后期的分离和纯化；第三、酶催化生产，采用粪链球菌（Streptococcusfaecalis）；单增李斯特菌（Listeriamonocytogenes）；乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）等微生物生产的精氨酸脱亚氨基酶催化精氨酸生产瓜氨酸；第四、微生物发酵法生产，直接发酵法产量高，产物纯度大，生产过程中没有有害物质生成，提取纯化方便，降低了成本，适合工业生产。
[0004]L
‑
瓜氨酸是谷氨酸家族的氨基酸，以谷氨酸为前体物质，经过8
‑
9种酶的催化最终合成L
‑r/>瓜氨酸。但L
‑
瓜氨酸作为中间代谢物在微生物体内并不会大量的积累，而是由精胺琥珀酸合成酶催化生成精氨酸，这导致瓜氨酸的含量较低。

技术实现思路

[0005]这对现有瓜氨酸生产中发酵产酸较低的不足，本专利技术的目的一在于一种发酵生产L
‑
瓜氨酸的大肠杆菌基因工程菌，目的二在于提供所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，目的三在于提供所述大肠杆菌基因工程菌在L
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瓜氨酸发酵生产中的应用，目的四在于提供一种发酵生产L
‑
瓜氨酸的方法。本专利技术利用基因工程技术手段，以大肠杆菌W3110为出发菌株进行基因工程改造，并优化了相对应的发酵控制方案，使L
‑
瓜氨酸的发酵产量得到明显提升。
[0006]本专利技术采用的具体方案为：发酵生产L
‑
瓜氨酸的大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌是以大肠杆菌W3110为宿主菌进行基因工程改造，对编码精胺琥珀酸合成酶的argG基因和编码精氨琥珀酸裂解酶的argH基因进行敲除；同时对编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因、谷氨酸
‑
丙酮酸氨基转移酶的alaA和编码L
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精氨酸ABC转运蛋白ATP结合亚基的artP基因进行过表达。
[0007]上述发酵生产L
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瓜氨酸的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，所述构建方法是采用CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术对宿主菌基因组上的argG和argH基因进行敲除，然后导入整合
gdhA、alaA和artP基因片段的质粒。
[0008]所述构建方法，具体包括以下步骤：步骤一、pGBR质粒的构建：采用引物Sg
‑
argG
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F、Sg
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argG
‑
R和Sg
‑
argH
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F、Sg
‑
argH
‑
R，通过PCR的方法分别构建含有靶序列的argG
‑
pGRB和argH
‑
pGRB质粒；其中，引物Sg
‑
argG
‑
F、Sg
‑
argG
‑
R和Sg
‑
argH
‑
F、Sg
‑
argH
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO：04~07所示；步骤二、重组DNA片段的制备：所述重组DNA片段由敲除基因的上下游同源臂组成；采用PCR的方法分别扩增敲除argG基因和敲除argH基因的上下游同源臂片段，然后连接上下游同源片段，分别制备敲除argG重组DNA片段和敲除argH重组DNA片段；步骤三、将pCas9质粒转化到大肠杆菌W3110中，制备含有pCas9质粒的W3110菌株感受态；步骤四、将步骤一构建的pGBR质粒、步骤二构建的重组DNA片段同时转化到步骤三所得含有pCas9质粒的W3110菌株感受态中，通过验证筛选阳性重组子，消除工具质粒，获取W3110
‑△
argG
‑△
argH突变菌株；步骤五、分别扩增gdhA、alaA、artP基因片段和PBR332质粒片段，通过基因重组的方法构建含有gdhA、alaA和artP基因的重组质粒，然后将所述重组质粒转入步骤四所得W3110
‑△
argG
‑△
argH突变菌株的感受态细胞中，通过阳性验证，获取发酵生产L
‑
瓜氨酸的大肠杆菌基因工程菌。
[0009]上述大肠杆菌基因工程菌在L
‑
瓜氨酸发酵生产中的应用。
[0010]一种发酵生产L
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瓜氨酸的方法，采用上述的大肠杆菌基因工程菌进行发酵生产。
[0011]作为对上述发酵生产L
‑
瓜氨酸的方法的进一步优化，发酵采用的发酵培养基配方为：葡萄糖：10
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30g/L，酵母粉2
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8g/L，蛋白胨2
‑
8g/L，硫酸镁1
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5g/L，硫酸铵1
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5g/L，磷酸氢二钾3
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7g/L，硫酸亚铁和硫酸锰15
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30mg/L，精氨酸0.1
‑
0.3g/L；其余为水，pH 6.8
‑
7.2。
[0012]作为对上述发酵生产L
‑
瓜氨酸的方法的进一步优化，发酵的工艺条件为：发酵液接种量为10%
‑
15%，pH 6.5
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7.5，培养温度为30
‑
40℃，通气量为0.2
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1.0m3/h，搅拌转速为100
‑
600r/min，发酵时间为30
‑
65h。
[0013]有益效果：本研究以大肠杆菌W3110为出发菌株，过表达谷氨酸脱氢酶的基因gdhA和谷氨酸
‑
丙酮酸氨基转移酶alaA，促进谷氨酸的生成，过表达编码L
‑
精氨酸ABC转运蛋白ATP结合亚基基因artP增强瓜氨酸向胞外转运，同时使用CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术对编码精胺琥珀酸合成酶的argG和argH基因进行删除，抑制L...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.发酵生产L
‑
瓜氨酸的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌是以大肠杆菌W3110为宿主菌进行基因工程改造，对编码精胺琥珀酸合成酶的argG基因和编码精氨琥珀酸裂解酶的argH基因进行敲除；同时对编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因、谷氨酸
‑
丙酮酸氨基转移酶的alaA和编码L
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精氨酸ABC转运蛋白ATP结合亚基的artP基因进行过表达。2.权利要求1所述的发酵生产L
‑
瓜氨酸的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述构建方法是采用CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术对宿主菌基因组上的argG和argH基因进行敲除，然后导入整合gdhA、alaA和artP基因片段的质粒。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、pGBR质粒的构建：采用引物Sg
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argG
‑
F、Sg
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argG
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R和Sg
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argH
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F、Sg
‑
argH
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R，通过PCR的方法分别构建含有靶序列的argG
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pGRB和argH
‑
pGRB质粒；其中，引物Sg
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argG
‑
F、Sg
‑
argG
‑
R和Sg
‑
argH
‑
F、Sg
‑
argH
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO：04~07所示；步骤二、重组DNA片段的制备：所述重组DNA片段由敲除基因的上下游同源臂组成；采用PCR的方法分别扩增敲除argG基因和敲除argH基因的上下游同源臂片段，然后连接上下游同源片段，分别制备敲除argG重组DNA片段和敲除argH重组DNA片段；步骤三、将pCas9质粒转化到大肠杆菌W3110中，制备含有pCas9质粒的W31...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴亚东，刘晓东，刘帅，王灿，李艳丹，宋会文，王军军，
申请(专利权)人：河南巨龙生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：