一种解淀粉芽孢杆菌底盘菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及工业微生物育种，特别涉及一种解淀粉芽孢杆菌底盘菌株及其应用。本发明专利技术提供了一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌基因组中缺失了噬菌体蛋白合成相关基因簇，作为适宜的底盘菌株，还可以进一步异源过表达耐酸性高温α

【技术实现步骤摘要】
一种解淀粉芽孢杆菌底盘菌株及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种解淀粉芽孢杆菌底盘菌株及其应用。

技术介绍

[0002]在众多的工业用酶中，主要产自微生物的耐酸性高温α
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淀粉酶的最适pH值为4.0～6.0，最适温度在24～115℃，多项研究表明耐酸性高温α
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淀粉酶可按照生产需求应用于以淀粉为原料的部分行业，可谓是淀粉深加工业的福音，例如可应用于淀粉深加工业生产各种黏着剂、浆糊等，生产各种糊精；应用于酿造发酵业进行原料的液化处理；应用于纺织品工业用于各种织物退浆以及用于医药行业制备消化助剂等；应用于饲料行业制备饲料添加剂；用于清洁行业制造清洁剂等。耐酸性高温α
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淀粉酶凭借其节约淀粉加工原料、降低不必要劳动力消耗、简化部分淀粉深加工的加工工艺、减少酸碱等废弃物的排放、促进经济发展的优势在酶制剂市场占有举足轻重的地位。
[0003]虽然产耐酸性高温α
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淀粉酶的菌株众多，但是各种菌株的产量有所不同，能够满足工业化大规模生产需求的菌株只有其中一小部分。据已有报道，与其他菌种相比芽孢杆菌发酵周期相对较短且易于操作、酶活力高。基于以上优点，工业化生产耐酸性高温α
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淀粉酶多用芽孢杆菌。解淀粉芽孢杆菌作为重要的工业用菌，对其基因组进行精简，在维持其基因稳定的同时，也能达到优化代谢网络，改善细胞的能量利用效率，提高细胞生理性能的预测性及可控性的目的，获得性能优秀的工业底盘。
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技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术的目的是通过对基因工程宿主的基因组精简改造，提供一种能够减缓菌体自溶或裂解的解淀粉芽孢杆菌底盘菌株，以及将其应用于生产耐酸性高温α
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淀粉酶能够显著提高产量。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采取如下的技术方案：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌基因组中缺失了如下基因：
[0007](a)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP018902.1所示的基因组第2058955
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2098506位的DNA片段，
[0008](b)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP018902.1所示的基因组第91163
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113038位的DNA片段，
[0009](c)核苷酸序列如NCBI GenBank:FN597644.1所示的基因组第3129769
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3164233位的DNA片段，
[0010](d)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP021505.1所示的基因组第1338404
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1369338位的DNA片段，
[0011]和可选的缺失了(e)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP054415.1所示的基因组第
905524
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928629位的DNA片段；
[0012]优选的，该基因工程菌还异源过表达耐酸性高温α
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淀粉酶基因。
[0013]第二方面，本专利技术提供了如上所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，包括：在解淀粉芽孢杆菌中，将所述(a)、(b)、(c)、(d)的基因全部或部分的敲除，和可选的将所述(e)的基因全部或部分的敲除，获得底盘菌株；优选的，进一步在底盘菌株中引入耐酸性高温α
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淀粉酶基因。
[0014]第三方面，本专利技术提供了如上所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌在生产耐酸性高温α
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淀粉酶中的应用。
[0015]第四方面，本专利技术提供一种高效生产耐酸性高温α
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淀粉酶的方法，所述方法是指在培养基中培养如上所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，并从其培养后的细胞和/或培养基中收集耐酸性高温α
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淀粉酶。
[0016]本专利技术的有益效果如下：
[0017]本专利技术从实验和生产中的实际情况出发，分析影响高密度发酵菌体裂解的不良因素。基因组岛是一类具有特定结构和功能的大片段DNA的总称，一般被认为是通过水平基因转移产生的，细菌可经过接合、转导、转化等方式获得基因组岛。本专利技术中通过基因组、转路组信息以及结合预测软件，预测得出解淀粉芽孢杆菌中噬菌体来源的基因组岛基因序列，并从中选取了噬菌体基因1，噬菌体基因2，噬菌体基因3，噬菌体基因4，噬菌体基因5序列作为靶基因缺失，进而有针对性地简化解淀粉芽孢杆菌基因组，去除非必需基因干扰，以降低基因组的复杂度，提高解淀粉芽孢杆菌对底物和能量的利用效率，最终获得能够表达异源蛋白的理想宿主细胞。
[0018]本专利技术提供了一种菌体裂解减缓且能够高产耐酸性高温α
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淀粉酶的解淀粉芽孢杆菌底盘菌株，在单个敲除噬菌体基因1，噬菌体基因2，噬菌体基因3，噬菌体基因4，噬菌体基因5后发现菌体自溶减缓；进一步在此基础上串联敲除以上噬菌体基因簇分别获得了重组菌，通过60h摇瓶发酵，发现24h发酵液酶活力最高达到910.4821U/mL，相比对照菌(674.33U/mL)提高了35％。串联敲除菌株在60h仍有效的表达耐酸性高温α
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淀粉酶，而且酶活分别是对照菌的1.34倍、1.44倍、2.05倍、1.51倍。说明串联敲除基因簇能够有效的提高活菌数量的同时显著提高高温α
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淀粉酶的酶活，此种方法也适合于提高其他外分泌蛋白的表达量。
附图说明
[0019]图1：基因敲除验证；其中，M：Marker；1：噬菌体基因1验证条带；2：噬菌体基因2验证条带；3：噬菌体基因3验证条带；4：噬菌体基因4为验证条带；5：噬菌体基因5验证条带。
[0020]图2：基因单个敲除菌株与对照菌株
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upp的生长曲线比较。
[0021]图3：基因单个敲除菌株与对照菌株
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upp的活菌计数比较。
[0022]图4：基因串联敲除菌株与对照菌株
△
upp的生长曲线比较。
[0023]图5：基因串联敲除菌株与对照菌株
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upp的活菌计数比较。
[0024]图6：基因串联敲除菌株和对照菌株
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upp表达耐酸性高温α
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淀粉酶的酶活比较。
具体实施方式
[0025]下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。
[0026]本专利技术用语“前噬菌体”或“噬菌体基因”是指温和噬菌体侵入其敏感宿主后，整合在宿主基因组上的核酸。示例性的，在本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌基因组中缺失了如下基因：(a)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP018902.1所示的基因组第2058955
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2098506位的DNA片段，(b)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP018902.1所示的基因组第91163
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113038位的DNA片段，(c)核苷酸序列如NCBI GenBank:FN597644.1所示的基因组第3129769
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3164233位的DNA片段，(d)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP021505.1所示的基因组第1338404
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1369338位的DNA片段，和可选的缺失了(e)核苷酸序列如NCBI GenBank:CP054415.1所示的基因组第905524
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928629位的DNA片段；优选的，该基因工程菌还异源过表达耐酸性高温α
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淀粉酶基因。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌基因组中缺失了所述(a)、(b)、(c)和(d)的基因，还异源过表达耐酸性高温α
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淀粉酶基因。3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌基因组中缺失了所述(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的基因，还异源过表达耐酸性高温α
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【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，李玉，史超硕，薛润泽，刘逸寒，李庆刚，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：