一种生产乙偶姻基因工程菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种生产乙偶姻基因工程菌株及其构建方法与应用，先筛选和鉴定影响大肠杆菌乙偶姻胁迫抗性的功能基因，利用基因组遗传改造手段引入抗逆因子以提高菌株对产物的耐受性，再通过优化重组质粒拷贝数提高乙偶姻合成途径关键基因的表达水平，获得高合成能力和高胁迫抗性的工程菌株；然后采用廉价原料发酵合成乙偶姻，并在适宜条件下高效转化生成四甲基吡嗪；最后使用脱色纯化后的发酵液转化得到了较高纯度的四甲基吡嗪。本发明专利技术工艺方法绿色环保，可生成高值化学品（R）

【技术实现步骤摘要】
一种生产乙偶姻基因工程菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种可提高乙偶姻耐受性的生产乙偶姻基因工程菌株及其构建方法，以及涉及该基因工程菌株在发酵生产乙偶姻的应用，并且涉及该乙偶姻发酵液合成生产四甲基吡嗪的应用。

技术介绍

[0002]四甲基吡嗪(Tetramethylpyrazine，TTMP)又名川芎嗪，是传统中药植物川芎中的主要活性生物碱成分，具有治疗心脑血管等疾病的药理作用。乙偶姻(Acetoin，AC)化学品名为3
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羟基
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丁酮，是合成四甲基吡嗪的前体，广泛应用于食品、医药、化工、生物燃料等行业。随着社会的快速发展，人们对乙偶姻和四甲基吡嗪的需求也越来越多，但利用传统的植物提取法获得四甲基吡嗪具有含量较低、成本过高等弊端，使用化学法合成乙偶姻或四甲基吡嗪工艺复杂，对环境污染大。
[0003]随着合成生物学的迅速发展，在微生物细胞中构建乙偶姻的异源合成途径，成为提高乙偶姻产量的重要研究手段，而高产量高浓度的乙偶姻前体是提高四甲基吡嗪合成产率的重要因素。越来越多的微生物细胞被改造成细胞工厂，这些工程菌株经过发酵往往可转化生成多种目标产物，但生产过程中，微生物细胞往往受到各种不利因素的胁迫，以致其生长代谢能力受到严重影响或完全丧失，最终生产效率也会下降。因此提高微生物细胞的胁迫抗性对提高菌株发酵生成目标产物的产量是非常必要的。增强微生物耐受性的传统方式主要包括耐受性驯化和通过物理或化学方式诱变，但这些方式普遍存在很多缺点，如实验周期长、工作任务重、优良表型易丢失等。与传统方法相比，通过分子生物学技术引入或改造某些抗逆因子为更加直接且有效的方式。
[0004]目前，国内外对微生物耐受多种有机溶剂的研究均有报道。Yongbo等人发现过表达来源于植物乳杆菌的基因murA2可以提高大肠杆菌对一些有机溶剂如乙醇、正丁醇、异丁醇的耐受性，进而可以提高大肠杆菌KO11发酵产乙醇的水平。Kamthan等人将来源于食用真菌金针菇的C
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5甾醇去饱和酶导入裂殖酵母中异源表达后，发现不仅可以增加菌株的耐热性，也提高了其在乙醇以及酸性溶液中的生长能力。Ayushi K等人对野生型大肠杆菌与耐受丁醇的大肠杆菌菌株的转录表达谱比较分析，发现野生型菌株中基因yibT和yghW的表达水平显著下调，最后通过敲除这两个基因，显著提高了菌株对丁醇的耐受能力。Foo等人发现MdlB基因是提高大肠杆菌对异戊烯醇耐受性的关键因子，然后通过将MdlB基因过表达，最终使菌株的耐受性得到提高，其发酵合成异戊烯醇的能力也提高了12％。Fisher等人比较了大肠杆菌Ac rB优良突变体和野生型大肠杆菌MG1655对正丁醇的耐受能力，发现突变体菌株的耐受性明显增强。由此可知，增强菌株对乙偶姻的耐受性对于提高菌株发酵合成乙偶姻能力是非常必要的，亦有助于提高后续产物四甲基吡嗪的合成产率。

技术实现思路

[0005]本专利技术在探究乙偶姻对大肠杆菌胁迫效应的基础上，提供了一种通过引入抗逆因
子构建生产乙偶姻基因工程菌株，提高了该菌株发酵产乙偶姻的能力；同时本专利技术还提供了利用该菌发酵生产乙偶姻，进一步利用乙偶姻发酵液合成生产四甲基吡嗪的工艺，通过对乙偶姻发酵液进行脱色以及采用高温高压反应条件，最终得到了较高转化率及较为纯净的四甲基吡嗪转化液。
[0006]具体的，本专利技术提供的生产乙偶姻基因工程菌株，是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在大肠杆菌GXASR10基因组脂肪酸合成基因Yibt位点整合单拷贝的蛋白质延伸因子EF
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Ts基因tsf，获得的工程菌株ΔGXASR10。
[0007]本专利技术所述大肠杆菌GXASR10为通过基因改造获得的生产乙偶姻的基因工程菌株。可采用本申请人在先申请的专利(例如：CN107129959A生产(R)
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乙偶姻基因工程菌株的构建方法及其应用、CN107177620A一种利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法)所记载的基因工程菌株。本专利技术优选采用多基因缺失的突变株E.coli MG1655ΔgldAΔfrdABCDΔackA
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ptaΔpoxB。
[0008]本专利技术提供的生产乙偶姻基因工程菌株，还包括在大肠杆菌GXASR10、ΔGXASR10分别转化表达重组质粒pTrc99a
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budB
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budA
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noxE，获得的工程菌株GXASR10/pTrc99a
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budB
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budA
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noxE(48#)、ΔGXASR10/pTrc99a
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budB
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budA
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noxE(Δ48#)。
[0009]本专利技术提供的生产乙偶姻基因工程菌株，还包括利用无缝克隆技术，将质粒pRSFDuet上的RSF复制子替换重组质粒pTrc99a
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budB
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budA
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noxE的复制子ori得到新的重组质粒，然后将该新的重组质粒在大肠杆菌GXASR10、ΔGXASR10分别转化表达，获得的工程菌株R48#、RΔ48#。
[0010]另外，本专利技术还提供了上述生产乙偶姻基因工程菌株ΔGXASR10的构建方法，包括以下步骤：
[0011]S21、根据大肠杆菌GXASR10基因组上的Yibt位点的基因序列，设计合成基因片段N20；然后以pTarget骨架基因片段作为模板，与基因片段N20进行无缝克隆连接，构建pTarget
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N20重组质粒；
[0012]S22、以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，分别扩增目的基因tsf、插入位点Yibt的上游同源臂及下游同源臂；同时将该目的基因tsf、插入位点Yibt的上游同源臂及下游同源臂进行拼接，获得打靶片段；然后将打靶片段电转入含有pCas质粒的大肠杆菌GXASR10中并进行PCR验证；
[0013]S23、使用测序成功的菌液进行进行pTarget
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N20和pCas9质粒的丢失。
[0014]另外，本专利技术还提供了上述生产乙偶姻基因工程菌株R48#、RΔ48#的构建方法，其是利用无缝克隆技术，将质粒pRSFDuet上的RSF复制子替换重组质粒pTrc99a
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budB
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budA
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noxE的复制子ori得到新的重组质粒，然后将该新的重组质粒在大肠杆菌GXASR10、ΔGXASR10分别转化表达得到的。其中，所述将质粒pRSFDuet上的RSF复制子替换重组质粒pTrc99a
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bud B
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budA
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noxE的复制子ori得到新的重组质粒，包括以下步骤：
[0015]S31、以质粒pRSFDuet为模板，RSF
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F/R为引物PCR扩增其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种生产乙偶姻基因工程菌株, 其特征在于，包括：（1）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在大肠杆菌GXASR10基因组脂肪酸合成基因Yibt位点整合单拷贝的蛋白质延伸因子EF
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Ts基因tsf，获得的工程菌株ΔGXASR10；（2）在大肠杆菌GXASR10、ΔGXASR10分别转化表达重组质粒pTrc99a
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noxE，获得的工程菌株GXASR10/pTrc99a
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noxE（48#）、ΔGXASR10/pTrc99a
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noxE（Δ48#）；（3）利用无缝克隆技术，将质粒pRSFDuet上的RSF复制子替换重组质粒pTrc99a
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budB
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noxE的复制子ori得到新的重组质粒，然后将该新的重组质粒在大肠杆菌GXASR10、ΔGXASR10分别转化表达，获得的工程菌株R48#、RΔ48#。2.如权利要求1所述生产乙偶姻基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述工程菌株ΔGXASR10的构建包括以下步骤：S21、根据大肠杆菌GXASR10基因组上的Yibt位点的基因序列，设计合成基因片段N20；然后以pTarget骨架基因片段作为模板，与基因片段N20进行无缝克隆连接，构建pTarget
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N20重组质粒；S22、以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，分别扩增目的基因tsf、插入位点Yibt的上游同源臂及下游同源臂；同时将该目的基因tsf、插入位点Yibt的上游同源臂及下游同源臂进行拼接，获得打靶片段；然后将打靶片段电转入含有pCas质粒的大肠杆菌GXASR10中并进行PCR验证；S23、使用测序成功的菌液进行进行pTarget
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N20和pCas9质粒的丢失。3.如权利要求1所述生产乙偶姻基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述将质粒pRSFDuet上的RSF复制子替换重组质粒pTrc99a
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budB
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budA
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noxE的复制子ori得到新的重组质粒，包括以下步骤：S31、以质粒pRSFDuet为模板，RSF
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F/R为...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢能中，陈先锐，刁梦雪，李检秀，蒙丽钧，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：