【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于基因工程，具体涉及一种komagataeibacter xylinus来源的启动子及其在高效生产细菌纤维素(bc)中的应用。
技术介绍
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技术介绍
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1、细菌纤维素(bc)是由葡萄糖单体通过β-1,4-糖苷键线性连接而成的一种多糖。与植物纤维素相比，bc具有高纯度、高机械强度、高结晶度、高亲水性以及优异的生物相容性和生物降解性。因此，bc被广泛应用于食品工业、生物医学材料、化妆品等领域。
2、komagataeibacter xylinus(木驹形杆菌)，能够高效合成细菌纤维素且培养条件简单，是工业产品的重要生产菌株。木驹形杆菌也是一种食品安全菌株，可被被安全地用于细菌纤维素的大规模工业生产。但是，缺乏高效的表达元件限制了其应用价值。
3、细胞的代谢通量主要受到转录水平的调控，而启动子是转录水平的重要调控元件，因此，启动子被列为合成生物学的重要功能元件之一。目前对木驹形杆菌来源启动子开发较少，更多的是利用外源的启动子，包括组成型启动子、诱导型启动子等。组成型启动子包括pj23104启动子等；诱导型启动子在诱导后通常可以达到较高表达强度，但使用诱导剂会增加生产成本，同时存在稳定性较差等问题。传统的代谢途径调控中大多选择宿主本身的天然启动子对基因表达进行调控。该类启动子能很好的用于菌株自身的基因工程改造，准确的开启基因的表达。
4、鉴于komagataeibacter xylinus是细菌纤维素的优良的生产菌株，开发其来源的表达元件，拓展其启动子库，对于进一步优化细菌
技术实现思路
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技术实现思路
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1、针对上述存在问题，本专利技术首先从komagataeibacter xylinus中获得一个内源启动子序列，然后利用该序列对komagataeibacter xylinus进行改造调控细菌纤维素生产途径，得到一株bc生产力强、抗染菌能力强的木驹形杆菌，拥有更广泛的应用前景。
2、本专利技术提供的技术方案之一，是一种komagataeibacter xylinus来源的启动子，所述启动子为pct154_10220，核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；
3、进一步的，所述启动子pct154_10220来源于komagataeibacter xylinuscgmccno.2955基因组。
4、进一步的，所述启动子pct154_10220的表达强度峰值不低于pbla质粒启动子pbla的19.6倍。
5、本专利技术提供的技术方案之二，是一种包含技术方案一所述启动子pct154_10220的表达盒、重组表达载体或重组菌株；
6、进一步地，所述重组表达载体采用的载体骨架可以是本领域的常用载体，包括但不限于pbrs、puc18和pseva321等。
7、优选的，所述重组表达载体采用的载体骨架为pbrs质粒；所述pbrs质粒是以pbla质粒为骨架，去掉启动子、核糖体结合位点(rbs)和终止子为基础，加入bamh1酶切位点、rbs、mrfp(红色荧光蛋白基因)、trrnb终止子形成的；所述pbrs质粒核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；
8、进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞包括但不限于komagataeibacterxylinus、大肠杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌等；
9、优选地，所述重组菌株采用的宿主细胞为komagataeibacter xylinus，如cgmccno.2955等。
10、本专利技术提供的技术方案之三，是所述启动子pct154_10220的应用，特别是在细菌纤维素合成中的应用，更特别的是在调控细菌纤维素合成相关基因表达中的应用；
11、进一步地，所述细菌纤维素合成相关基因包括但不限于磷酸葡萄糖转移酶系统相关基因和磷酸果糖激酶基因pfka、二磷酸尿核苷-葡萄糖焦磷酸化酶galu、葡萄糖磷酸变位酶pgm和内切-β-1,4-葡聚糖酶cmcax等；优选磷酸葡萄糖转移酶系统相关基因和磷酸果糖激酶基因pfka；所述磷酸葡萄糖转移酶系统相关基因包括ptshicrr，ptsg基因等。
12、本专利技术提供的技术方案之四，是一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将技术方案一所述启动子与目的基因可操作地连接，优选地增强细菌代谢及bc合成相关基因的表达。
13、本专利技术提供的技术方案之五，是一种基因工程菌，所述工程菌以komagataeibacter xylinus为出发菌株，敲除基因组上的葡萄糖脱氢酶编码基因gdh，并外源表达磷酸葡萄糖转移酶系统相关基因和磷酸果糖激酶基因pfka；
14、进一步地，所述磷酸葡萄糖转移酶系统相关基因包括ptshicrr，ptsg基因等；
15、更进一步地，所述基因工程菌，以cgmcc no.2955为出发菌株，敲除基因组上的葡萄糖脱氢酶编码基因gdh，并通过包含启动子pct154_10020和trrnb终止子的pbrs质粒外源表达磷酸葡萄糖转移酶系统相关ptshicrr，ptsg基因和磷酸果糖激酶基因pfka获得；所获得的基因工程菌命名为木驹形杆菌(komagataeibacter xylinus)kx pts3，该菌株已于2023年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号cgmcc no.27861；
16、进一步地，所述葡萄糖脱氢酶编码基因gdh，核苷酸序列如序列表seq id no.3所示；
17、进一步地，所述ptshicrr基因是编码磷酸转运蛋白hpr、磷酸转运酶ei及葡萄糖特异性转运蛋白eiia的基因簇，包括ptsh、ptsi和crr3个基因(geneid：946886、946879、946880)，来自大肠杆菌，核苷酸序列如序列表seq id no.4所示；
18、进一步地，所述ptsg基因编码葡萄糖特异性转运蛋白eiicb，来自大肠杆菌，核苷酸序列如序列表seq id no.5所示；
19、进一步地，所述磷酸果糖激酶基因pfka(geneid：948412)，来自大肠杆菌，核苷酸序列如序列表seq id no.6所示。
20、本专利技术提供的技术方案之六，是技术方案五所述基因工程菌的应用，特别是在生产细菌纤维素中的应用；
21、进一步地，采用所述基因工程菌生产细菌纤维素的方法如下：
22、种子培养：将木驹形杆菌cgmcc no.27861按1-5％接种量接种至hs液体培养基中，加入1-5％纤维素酶，培养基中加入终浓度为50-80μg/ml的卡那霉素，30-40℃，180-200rpm，培养48-60h；
23、发酵培养：用无菌pbs清洗种子液菌体，将纤维素酶清洗干净并重悬菌体，按初始od为0.02-0.2接种至含有葡萄糖为碳源的hs本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Komagataeibacter xylinus来源的启动子，其特征在于，所述启动子为PCT154_10220，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.包含权利要求1所述启动子PCT154_10220的表达盒、重组表达载体或重组菌株。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，采用的载体骨架为pBRS质粒，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，采用的宿主细胞为CGMCC No.2955。
5.权利要求1所述启动子PCT154_10220的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，是在调控细菌纤维素合成相关基因表达中的应用。
7.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌，以CGMCC No.2955为出发菌株，敲除基因组上的葡萄糖脱氢酶编码基因gdh，并通过包含启动子PCT154_10020和TrrnB终止子的pBRS质粒外源表达磷酸葡萄糖转移酶系统相关ptsHIcrr，ptsG基因和磷酸果糖激酶基因pfkA获得。
<...【技术特征摘要】
1.一种komagataeibacter xylinus来源的启动子，其特征在于，所述启动子为pct154_10220，核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。
2.包含权利要求1所述启动子pct154_10220的表达盒、重组表达载体或重组菌株。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，采用的载体骨架为pbrs质粒，核苷酸序列如序列表seq id no.2所示。
4.如权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，采用的宿主细胞为cgmcc no.2955。
5.权利要求1所述启动子pct154_10220的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，是在调控细菌纤维素合成相关基因表达中的应用。
7.一种基因工程菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟成，辛波，彭昭君，刘嘉恒，吕子龙，李金洋，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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