提高谷氨酸棒杆菌生产色氨酸的方法技术

本发明专利技术提供一种提高谷氨酸棒杆菌生产色氨酸的方法。本发明专利技术通过表达外源的磷酸转酮酶基因xfp和磷酸乙酰转移酶基因pta，实现了细胞内赤鲜糖

【技术实现步骤摘要】
提高谷氨酸棒杆菌生产色氨酸的方法


[0001]本专利技术属于生物化工
，具体地说，涉及一种提高谷氨酸棒杆菌生产色氨酸的方法。

技术介绍

[0002]色氨酸是一种重要的人体必需氨基酸，在生物医药、饲料添加剂、营养保健等领域有十分广泛的应用。目前色氨酸的生产主要是通过微生物发酵的方式进行，常用的发酵菌株包括谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌等。色氨酸的生物合成途径长，代谢途径中的酶受到一系列的代谢调控，因此目前色氨酸的产量较低，导致其生产成本仍然较高，因此开发色氨酸的高产菌株具有十分重要的意义。
[0003]色氨酸生物合成途径的两个关键代谢前体是赤鲜糖
‑4‑
磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸，二者通过3
‑
脱氧
‑
D
‑
阿拉伯糖庚酮糖
‑7‑
磷酸合酶的催化下合成3
‑
脱氧
‑
D
‑
阿拉伯糖庚酮糖
‑7‑
磷酸，从而进入到分支酸合成途径，进一步通过一系列的酶促反应合成色氨酸。因此，如何提高细胞内赤鲜糖
‑4‑
磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的含量对于色氨酸的生物合成具有重要的重要。细胞内赤鲜糖
‑4‑
磷酸参与到戊糖磷酸循环，而磷酸烯醇式丙酮酸参与到糖酵解以及葡萄糖的转运等，因此如何有效地平衡二者的供给，在不影响细胞生长的条件下提高色氨酸的产量是一个重要的挑战。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种提高谷氨酸棒杆菌生产色氨酸的方法。
[0005]本专利技术构思如下：本专利技术提供一种不影响糖代谢以及细胞生长而能有效提高赤鲜糖
‑4‑
磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的方法，从而显著提高色氨酸的产量。具体地，通过在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中引入外源的磷酸转酮酶和磷酸乙酰转移酶途径，使得细胞内的葡萄糖
‑6‑
磷酸被分解为赤鲜糖
‑4‑
磷酸和乙酰
‑
CoA，从而在细胞内额外创造了一条赤鲜糖
‑4‑
磷酸的合成途径。进一步地，本专利技术结合失活谷氨酸棒杆菌内丙酮酸激酶基因pyk，提高细胞内磷酸烯醇式丙酮酸的含量。通过二者的结合，显著提高了色氨酸的产量。
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌是将外源的磷酸转酮酶基因和磷酸乙酰转移酶基因分别经密码子优化后，通过质粒导入谷氨酸棒杆菌中或通过基因工程手段整合到谷氨酸棒杆菌染色体上构建得到的。
[0007]进一步地，在所述重组谷氨酸棒杆菌的基础上失活丙酮酸激酶基因。
[0008]优选地，所述磷酸转酮酶基因来源于青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，所述磷酸乙酰转移酶基因来源于双氮养弧菌(Vibrio diazotrophicus)。
[0009]更优选地，优化的磷酸转酮酶基因序列如SEQ ID NO:1所示，优化的磷酸乙酰转移酶基因序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]本专利技术中，出发菌株可以是谷氨酸棒杆菌ATCC 21851。
[0011]第二方面，本专利技术提供重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，所述方法包括：在谷氨酸棒杆菌中过表达来源于青春双歧杆菌的磷酸转酮酶基因xfp和来源于双氮养弧菌的磷酸乙酰转移酶基因pta。
[0012]进一步地，失活谷氨酸棒杆菌的丙酮酸激酶基因pyk(SEQ ID NO:3)。
[0013]具体地，所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法包括以下步骤：
[0014]A、重组质粒pEC
‑
xfp
‑
pta的构建
[0015]a1、人工合成密码子优化的磷酸转酮酶基因xfp，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示，同时人工合成密码子优化的磷酸乙酰转移酶基因pta，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0016]a2、以人工合成的xfp基因序列为模板，以xfp
‑
F和xfp
‑
R为引物进行PCR，获得包含核糖体结合位点的xfp基因片段并进行PCR产物纯化；以人工合成的pta基因序列片段为模板，以pta
‑
F和pta
‑
R为引物进行PCR，获得包含核糖体结合位点的pta基因片段并进行PCR产物纯化；
[0017]a3、将谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pEC
‑
K18mob用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将带有核糖体结合位点的xfp基因片段和pta基因片段连接到pEC
‑
K18mob上，获得的重组质粒命名为pEC
‑
xfp
‑
pta；
[0018]B、重组质粒pK18
‑
pyk的构建
[0019]b1、以谷氨酸棒杆菌ATCC 21851的基因组为模板，以pyk
‑
up
‑
F和pyk
‑
up
‑
R为引物进行PCR，获得基因片段pyk
‑
up并进行PCR产物纯化；以谷氨酸棒杆菌ATCC 21851的基因组为模板，以pyk
‑
down
‑
F和pyk
‑
down
‑
R为引物进行PCR，获得基因片段pyk
‑
down并进行PCR产物纯化；
[0020]b2、将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将基因片段pyk
‑
up、pyk
‑
down一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18
‑
pyk；
[0021]C、重组菌C.glutamicum
‑△
pyk的构建
[0022]将重组质粒pK18
‑
pyk转化到谷氨酸棒杆菌ATCC 21851中，获得的重组菌命名为C.glutamicum
‑△
pyk；
[0023]D、重组菌C.glutamicum
‑△
pyk/pEC
‑
xfp
‑
pta的构建
[0024]将重组质粒pEC
‑
xfp
‑
pta转化到重组菌C.glutamicum
‑△
pyk中，获得的重组菌命名为C.glutamicum
‑△
pyk/pEC
‑
xfp
‑
pta。
[0025]其中，引物序列如下：
[0026]xfp
‑
F：5
′‑
gctatgaca本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌是将外源的磷酸转酮酶基因和磷酸乙酰转移酶基因分别经密码子优化后，通过质粒导入谷氨酸棒杆菌中或通过基因工程手段整合到谷氨酸棒杆菌染色体上构建得到的。2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在所述重组谷氨酸棒杆菌的基础上失活丙酮酸激酶基因。3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述磷酸转酮酶基因来源于青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，所述磷酸乙酰转移酶基因来源于双氮养弧菌(Vibrio diazotrophicus)。4.根据权利要求3所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，优化的磷酸转酮酶基因序列如SEQ ID NO:1所示，优化的磷酸乙酰转移酶基因序列如SEQ ID NO:2所示。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，出发菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC 21851。6.重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括：在谷氨酸棒杆菌中过表达来源于青春双歧杆菌的磷酸转酮酶基因xfp和来源于双氮养弧菌的磷酸乙酰转移酶基因pta。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，失活谷氨酸棒杆菌的丙酮酸激酶基因pyk。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、重组质粒pEC
‑
xfp
‑
pta的构建a1、人工合成密码子优化的磷酸转酮酶基因xfp，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示，同时人工合成密码子优化的磷酸乙酰转移酶基因pta，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示；a2、以人工合成的xfp基因序列为模板，以xfp
‑
F和xfp
‑
R为引物进行PCR，获得包含核糖体结合位点的xfp基因片段并进行PCR产物纯化；以人工合成的pta基因序列片段为模板，以pta
‑
F和pta
‑
R为引物进行PCR，获得包含核糖体结合位点的pta基因片段并进行PCR产物纯化；a3、将谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pEC
‑
K18mob用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将带有核糖体结合位点的xfp基因片段和pta基因片段连接到pEC
‑
K18mob上，获得的重组质粒命名为pEC
‑
xfp
‑
pta；B、重组质粒pK18
‑
pyk的构建b1、以谷氨酸棒杆菌ATCC 21851的基因组为模板，以pyk
‑
up
‑
F和pyk
‑
up
‑
R为引物进行PCR，获得基因片段pyk
‑
up并进行PCR产物纯化；以谷氨酸棒杆菌ATCC 21851的基因组为模板，以pyk
‑
down
‑
F和pyk
‑
down
‑
R为引物进行PCR，获得基因片段pyk
‑
down并进行PCR产物纯化；b2、将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将基因片段pyk
‑
up、pyk
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：陈振，董雨菲，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：