一种生产L-酪氨酸的重组菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种生产L

【技术实现步骤摘要】
一种生产L
‑
酪氨酸的重组菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种生产L
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酪氨酸的重组菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]L
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酪氨酸是一种重要的氨基酸，是对羟基肉桂酸、左旋多巴及对羟基苯乙烯的制备原料，广泛应用于食品医药及化妆品行业。
[0003]L
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酪氨酸的制备方法主要有提取法、化学合成法及生物转化法。提取法主要以天然蛋白质资源为原料，经水解、脱色及结晶等步骤提取L
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酪氨酸，这种方法的高成本、低产率限制了其工业化应用。化学合成法是通过L
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苯丙氨酸羟基化或由对羟基苯甲醛与海因缩合、碱解、转氨等步骤合成，这种方法步骤复杂、能耗高且产生大量的污染物，已逐渐被淘汰。生物转化法具备特异性高、绿色环保、反应条件温和及无需多步分离纯化等优点，目前已经受到了广泛的关注。
[0004]生物转化法分为微生物发酵法及酶催化法。微生物发酵法的工艺控制过程复杂，工艺条件既要适合微生物自身的生长，又有利于代谢产物的积累，生产周期长、效率低，不适合工业化应用。因此，一种有效的、温和的酶催化法是制备L
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酪氨酸的最佳选择。目前，文献报道了多种L
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酪氨酸的酶催化法制备路线，Sha Xu等筛选出了源于菌Erwinia herbicola的酪氨酸酚裂解酶(TPL)，以丙酮酸、氨及苯酚为底物转化制备L
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酪氨酸，最终可获得48.5g/L的L
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酪氨酸，但是，丙酮酸的价格较为昂贵，因此，陈明亮等以甘氨酸和甲醛为底物，经醛缩酶及D
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丝氨酸脱水酶转化生成丙酮酸，再添加氨、苯酚及TPL，合成L
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酪氨酸，经11h转化，L
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酪氨酸产量达117g/L。中国专利CN103224972以富含L
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丝氨酸的混合氨基酸料液为底物，添加适量苯酚，以丝氨酸脱氨酶及酪氨酸酚裂解酶双酶催化合成L
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酪氨酸。
[0005]以上报道的L
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酪氨酸催化法制备路线均涉及到毒性较大的苯酚或甲醛，这给放大生产过程中的安全管理带来了极大的挑战，且最终获得的L
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酪氨酸成品中可能会残留这两种有害物质，限制了其应用范围，因此，创建一条效率高、毒性低的L
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酪氨酸制备方法迫在眉睫。
[0006]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种生产L
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酪氨酸的重组菌及其构建方法和应用，通过该重组菌生产L
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酪氨酸，生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。
[0008]本专利技术是这样实现的：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种生产L
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酪氨酸的重组菌，重组菌中含有外源基因；外源基因包括编码了苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶、苯丙氨酸羟化酶、喋呤4a
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甲醇胺脱水酶及二氢喋呤还原酶的基因。
[0010]本专利技术首次提出，通过苏氨酸醛缩酶(LTA)将苯甲醛及甘氨酸转化为β
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苯丝氨酸，
通过苏氨酸脱氨酶(TD)将β
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苯丝氨酸转化为苯丙酮酸，通过亮氨酸脱氢酶(LeuDH)及NADH将苯丙酮酸转化为L
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苯丙氨酸，在苯丙氨酸羟化酶(P4H)、O2及四氢喋呤(MH4)的作用下生成L
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酪氨酸，喋呤4a
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甲醇胺脱水酶(PCD)及二氢喋呤还原酶(DHMR)用于MH4的循环再生，反应过程中所需NADH由菌体代谢葡萄糖来提供，反应原理如下所示：
[0011][0012]根据上述反应原理，专利技术人将编码苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶、苯丙氨酸羟化酶、喋呤4a
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甲醇胺脱水酶及二氢喋呤还原酶的基因导入宿主菌中，获得一种重组菌，以该重组菌作为生物催化剂，可廉价低毒底物苯甲醛及甘氨酸转化为L
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酪氨酸。
[0013]在一些实施方式中，苏氨酸醛缩酶包括AhLTA和PsLTA，AhLTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；PsLTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]在本专利技术中，AhLTA来源于Aeromonas hydrophila，Genbank编号为CAD7528144.1；PsLTA来源于Pseudomonas aeruginosa，Genbank编号为OPF27990.1。专利技术人在获得苏氨酸醛缩酶AhLTA和PsLTA的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
[0015]在一些实施方式中，AhLTA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；PsLTA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0016]在一些实施方式中，苏氨酸脱氨酶包括VaTD和PvTD，VaTD的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；PvTD的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0017]在本专利技术中，VaTD来源于Vibrio aestuarianus，Genbank编号为CAD7528144.1；PvTD来源于Pseudomonas veronii，Genbank编号为CAD0262619.1。专利技术人在获得苏氨酸脱氨酶VaTD和PvTD的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
[0018]在一些实施方式中，VaTD的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；PvTD的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0019]在一些实施方式中，亮氨酸脱氢酶包括FgLeuDH和AmLeuDH，FgLeuDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；AmLeuDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0020]在本专利技术中，FgLeuDH来源于Flavobacterium gilvum，Genbank编号为KFC59129.1；AmLeuDH来源于Alteromonas mediterranea，Genbank编号为AGQ00979.1。专利技术人在获得亮氨酸脱氢酶FgLeuDH和AmLeuDH的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
[0021]在一些实施方式中，FgLeuDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；AmLeuDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0022]在一些实施方式中，苯丙氨酸羟化酶包括VcP4H和PaP4H，VcP4H的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；PaP4H的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
[0023]在本专利技术中，VcP4H来本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产L
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酪氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌中含有外源基因；所述外源基因包括编码苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶、苯丙氨酸羟化酶、喋呤4a
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甲醇胺脱水酶及二氢喋呤还原酶的基因。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述苏氨酸醛缩酶包括AhLTA和PsLTA，所述AhLTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PsLTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述苏氨酸脱氨酶包括VaTD和PvTD，所述VaTD的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述PvTD的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；优选地，所述亮氨酸脱氢酶包括FgLeuDH和AmLeuDH，所述FgLeuDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述AmLeuDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；优选地，所述苯丙氨酸羟化酶包括VcP4H和PaP4H，所述VcP4H的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述PaP4H的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；优选地，所述喋呤4a
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甲醇胺脱水酶包括ApPCD和GaPCD，所述ApPCD的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述GaPCD的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；优选地，所述二氢喋呤还原酶包括PvDHMR和KmDHMR，所述PvDHMR的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述KmDHMR的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述苏氨酸醛缩酶中AhLTA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；PsLTA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；优选地，所述苏氨酸脱氨酶中VaTD的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；PvTD的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；优选地，所述亮氨酸脱氢酶中FgLeuDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；AmLeuDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；优选地，所述苯丙氨酸羟化酶中VcP4H的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；PaP4H的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；优选地，所述喋呤4a
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甲醇胺脱水酶中ApPCD的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；GaPCD的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；优选地，所述二氢喋呤还原酶中PvDHMR的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；KmDHMR的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。4.根据权利要求1
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3任一项所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主为大肠杆菌；优选地，所述大肠杆菌选自Escherichia coliBL21、Escherichia coliDH5α和Escherichia coli XL
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Blue中的任意一种。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：