【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，具体而言，涉及一种生产丹参素的方法。
技术介绍
1、丹参素，又称为β-(3,4-二羟基苯基)乳酸、丹参酸甲，是一种天然存在的植物多酚酸，其具有卓越的清除羟基自由基及超氧阴离子自由基的抗氧化活性，具有改善脑血流、抑制血小板活化、抗癌及抗炎等药理活性，此外，其多种衍生物在医疗行业也具有广泛的应用。
2、丹参素的制备方法主要有植物提取法、化学合成法及生物转化法。提取法主要以丹参为原料，但是其中丹参素含量较低、提取效率较低，这阻碍此法的大规模应用。化学合成法具有副产物多、步骤繁琐、产物光学纯度低等缺陷，不适合工业化生产。生物转化法具备特异性高、绿色环保、反应条件温和及无需多步分离纯化等优点，目前已经受到了广泛的关注。
3、目前，国内外学者报道了一些丹参素的生物法制备路线，例如chao li等以苯丙酮酸为底物，经扁桃酸脱氢酶转化获得苯乳酸，再经苯丙氨酸-4-羟化酶催化获得4-羟基苯乳酸，最后通过羟基苯乳酸3-羟化酶催化获得丹参素，过程中需要甲酸脱氢酶、二氢碟呤还原酶、碟呤-4a-甲醇胺脱水酶的参与实现辅酶四氢碟呤及nadh的再生，而且产物产量较低；中国专利cn108424937以左旋多巴为底物，经酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶及葡萄糖脱氢酶偶联转化获得丹参素，在最优实施例中，摩尔转化率达60.8％。
4、以上报道的丹参素生物合成路线具有生产效率低，底物成本高，辅酶再生效率低等缺点，因此，创建一条效率高、成本低的丹参素制备方法迫在眉睫。
5、鉴于此，特提出本专利技术。p>
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种生产丹参素的方法，该方法是以丁香酚为底物，利用能够表达苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶及o-脱甲基酶的重组菌作为催化剂进行全细胞转化，获得丹参素。
2、本专利技术提供了一种新的丹参素的合成路线，其为：通过苯乙烯单加氧酶(styrenemonooxygenase，smo)将丁香酚转化为2-甲氧基-4-(环氧乙烷基甲基)苯酚，通过(epoxidehydrolase，eh)将2-甲氧基-4-(环氧乙烷基甲基)苯酚转化为4-羟基-3-甲氧基苯基-1,2-二醇，通过乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，adh)将4-羟基-3-甲氧基苯基-1,2-二醇转化为2-羟基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙醛，通过(acetaldehyde dehydrogenase，aldh)将2-羟基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙醛转化为2-羟基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸，在o-脱甲基酶(o-demethylases)的作用下生成丹参素，反应过程中所需辅酶由菌体代谢葡萄糖来提供。具体路线如图1所示。
3、上述合成方式是通过构建重组菌表达smo、eh、adh、aldh和o-脱甲基酶，再将其作为催化剂进行全细胞转化合成丹参素。
4、本专利技术是这样实现的：
5、第一方面，本专利技术提供了一种生产丹参素的重组菌，该重组菌表达smo、eh、adh、aldh和o-脱甲基酶。
6、其中，smo包括bcsmo和rosmo，bcsmo来源于bacillus cereus，genbank编号kab2430945.1，其核苷酸序列如seq id no.11所示，氨基酸序列如seq id no.1所示；rosmo来源于rhodococcus opacus，genbank编号aii82583.1，其核苷酸序列如seq id no.12所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。
7、eh包括mkeh和aveh；mkeh来源于mycobacterium kansasii，genbank编号kep41268.1，其核苷酸序列如seq id no.13所示，氨基酸序列如seq id no.3所示；aveh来源于actinomadura verrucosospora，genbank编号qkg19196.1，其核苷酸序列如seq idno.14所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。
8、adh包括sladh和rfadh；sladh来源于streptomyces laurentii，genbank编号bau87583.1，其核苷酸序列如seq id no.15所示，氨基酸序列如seq id no.5所示；rfadh来源于rhizobium favelukesii，genbank编号cdm56854.1，其核苷酸序列如seq id no.16所示，氨基酸序列如seq id no.6所示。
9、aldh包括ttaldh和mraldh；ttaldh来源于thermanaeromonas toyohensis，genbank编号smb99042.1，其核苷酸序列如seq id no.17所示，氨基酸序列如seq id no.7所示；mraldh来源于mycolicibacterium rhodesiae，genbank编号ehb59049.1，其核苷酸序列如seq id no.18所示，氨基酸序列如seq id no.8所示。
10、o-脱甲基酶包括spodem和smodem；spodem来源于sphingomonas paucimobilis，genbank编号bad61059.1，其核苷酸序列如seq id no.19所示，氨基酸序列如seq id no.9所示；smodem来源于stenotrophomonas maltophilia，genbank编号aav53699.1，其核苷酸序列如seq id no.20所示，氨基酸序列如seq id no.10所示。
11、专利技术人在获得上述酶的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
12、在一些实施例中，上述重组菌的构建方法包括：将smo、eh、adh、aldh和o-脱甲基酶的基因连接到双启动子表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌株中，即获得重组菌。
13、在一些实施例中，重组菌的出发菌株为大肠杆菌。在其他实施方式中，重组菌的出发菌株可以是其他细菌，本专利技术不对其进行具体的限定。
14、在一些实施例中，大肠杆菌选自escherichia colibl21(de3)、escherichiacolidh5α和escherichiacolixl-blue中的任意一种。
15、在一些实施例中，双启动子表达载体包括pet28a、pcdfduet-1质粒和pacycduet-1质粒。
16、在本专利技术中，在上述smo、eh、adh、aldh和o-脱甲基酶中各选一个酶，进行五酶组合共表达，对于导入携带上述酶的编码基因的质粒的方式，可以是其中任意两个编码基因存在于同一质粒上，还可以是五种基因分别存在于不同的质粒上，也可以是其他导入方式，对此本专利技术不做限定。
17、较为优选地，采用pet28a本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合成丹参素的重组菌，其特征在于，包含编码苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶及O-脱甲基酶的基因。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述苯乙烯单加氧酶包括BcSMO和RoSMO；所述BcSMO的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RoSMO的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将葡萄糖转化为丹参素功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶及O-脱甲基酶的基因；
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
7.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3所述的全细胞催化剂，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的微生物细胞在合成丹参素及其下游产物中的应用。
8.一种合成丹参素
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系中包括：丁香酚1-50g/L，葡萄糖1-20g/L，重组菌体量1-50g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为10-24h。
...【技术特征摘要】
1.一种合成丹参素的重组菌，其特征在于，包含编码苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶及o-脱甲基酶的基因。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述苯乙烯单加氧酶包括bcsmo和rosmo；所述bcsmo的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述rosmo的氨基酸序列如seq idno.2所示；
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将葡萄糖转化为丹参素功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶及o-脱甲基酶的基因；
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦勇，杨波，张炜，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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