【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体而言，涉及一种用于生产肉桂酸及其衍生物的基因工程菌、其构建方法和应用。
技术介绍
1、肉桂酸，又名β-苯丙烯酸、3-苯基-2-丙烯酸，是一种有机物，化学式为c9h8o2，是从肉桂皮或安息香分离出的有机酸。植物中由苯丙氨酸脱氨降解产生的苯丙烯酸。肉桂酸主要用于香精香料、食品添加剂、医药工业、美容、农药、有机合成等方面。
2、3,4-二羟基肉桂酸，又名咖啡酸，广泛存在于各种植物体内，可以作为一种天然的抗氧化剂，被广泛应用于化妆品、食品医药等行业，同时，其也是合成咖啡酸类衍生物的重要前体化合物，可以用于合成绿原酸及咖啡酸苯乙酯等多种具有高附加值的产物。
3、肉桂酸及其衍生物(比如咖啡酸)的制备方法主要有提取法、化学合成法及生物转化法。提取法主要以天然植物为原料，经萃取、浸泡等步骤提取获得咖啡酸，这种方法的高成本、低产率、低纯度限制了其工业化应用。化学合成法具有副产物多、提纯困难、反应条件难以控制等缺陷，不适合大规模工业化生产。现有的肉桂酸及其衍生物生物合成路线具有产量低、生产效率低，底物成本高，反应周期长等缺点；比如中国专利cn106701843以邻苯二酚、丙酮酸及氨为底物，经酪氨酸苯裂合酶及酪氨酸氨基裂合酶作用生成咖啡酸，最终获得的最大咖啡酸产量仅为35.5mg/l。因此，开发一种产量高、生产效率高、成本低的肉桂酸及其衍生物的制备方法更具应用价值。
4、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种
2、本专利技术为了改善肉桂酸及其衍生物在现有技术中存在的产量低、生产效率低、底物成本高以及反应周期长等缺陷，提供了新的制备路线。
3、针对肉桂酸，本专利技术以苯丙烯为原料，通过香草醇氧化酶将苯丙烯转化为肉桂醇，通过松柏醇脱氢酶将肉桂醇转化为肉桂醛，在松柏醛脱氢酶的作用下生成肉桂酸，反应过程中还需辅酶，反应原理如图1所示。当然，只要是能够将苯丙烯转化为肉桂醇的酶或者能够将肉桂醇转化为肉桂醛的酶或者能够将肉桂醛转化成肉桂酸的酶，均适用于本专利技术；比如乙醇脱氢酶(ec1.1.1.1)或肉桂醇脱氢酶(ec1.1.1.195)可替换cala，乙醛脱氢酶(ec1.2.1.3)或乙醛氧化酶(ec1.2.3.1)可替换calb等等；本专利技术不对这类酶进行逐一列举。本专利技术并不限定具体的某一种酶。
4、针对3,4-二羟基肉桂酸，本专利技术以丁香酚为原料，通过o-脱甲基酶将丁香酚转化为4-烯丙基儿茶酚，通过香草醇氧化酶将4-烯丙基儿茶酚转化为3,4-二羟基肉桂醇，通过松柏醇脱氢酶将3,4-二羟基肉桂醇转化为3,4-二羟基肉桂醛，在松柏醛脱氢酶的作用下生成3,4-二羟基肉桂酸，反应过程中还需辅酶，反应原理如图2所示。当然，只要是能够将丁香酚转化为4-烯丙基儿茶酚的酶或者能够将4-烯丙基儿茶酚转化为3,4-二羟基肉桂醇或者能够将3,4-二羟基肉桂醇转化为3,4-二羟基肉桂醛的酶或者能够将3,4-二羟基肉桂醛转化成3,4-二羟基肉桂酸的酶，均适用于本专利技术；比如乙醇脱氢酶(ec1.1.1.1)或肉桂醇脱氢酶(ec1.1.1.195)可替换cala，乙醛脱氢酶(ec1.2.1.3)或乙醛氧化酶(ec1.2.3.1)可替换calb等等；本专利技术不对这类酶进行逐一列举。本专利技术并不限定具体的某一种酶。
5、基于上述制备路线，本专利技术特提供了一种基因工程菌，其共表达香草醇氧化酶(vaoa)、松柏醇脱氢酶(cala)及松柏醛脱氢酶(calb)，或是共表达o-脱甲基酶(o-demethylases)、香草醇氧化酶(vaoa)、松柏醇脱氢酶(cala)及松柏醛脱氢酶(calb)。
6、根据上述反应原理，专利技术人将编码香草醇氧化酶和氧化还原酶的基因导入宿主菌中，获得一种基因工程菌，以该基因工程菌作为生物催化剂，可将底物苯丙烯转化为肉桂酸；将编码o-脱甲基酶、香草醇氧化酶和氧化还原酶的基因导入宿主菌中，获得另一种基因工程菌，以该基因工程菌作为生物催化剂，可将底物丁香酚转化为3,4-二羟基肉桂酸。
7、在一些实施例中，o-脱甲基酶包括spodem和smodem；spodem的氨基酸序列如seqid no.1所示；smodem的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8、在本专利技术中，spodem来源于sphingomonas paucimobilis，genbank编号为bad61059.1；smodem来源于stenotrophomonas maltophilia，genbank编号为aav53699.1。专利技术人在获得o-脱甲基酶spodem和smodem的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
9、在一些实施例中，spodem的核苷酸序列如seq id no.3所示；smodem的核苷酸序列如seq id no.4所示。
10、在一些实施例中，香草醇氧化酶包括fvvaoa和ssvaoa；fvvaoa的氨基酸序列如seqid no.5所示；ssvaoa的氨基酸序列如seq id no.6所示。
11、在本专利技术中，fvvaoa来源于fusarium verticillioides，genbank编号为afj11909.1；ssvaoa来源于sphaerobolus stellatus，genbank编号为kij23712.1。专利技术人在获得香草醇氧化酶fvvaoa和ssvaoa的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
12、在一些实施例中，fvvaoa的核苷酸序列如seq id no.7所示；ssvaoa的核苷酸序列如seq id no.8所示。
13、在一些实施例中，松柏醇脱氢酶包括ppcala和sscala；ppcala的氨基酸序列如seqid no.9所示；sscala的氨基酸序列如seq id no.10所示。
14、在本专利技术中，ppcala来源于sphingomonas paucimobilis，genbank编号为aan68038.1；sscala来源于stenotrophomonas maltophilia，genbank编号为ban09098.1。专利技术人在获得松柏醇脱氢酶ppcala和sscala的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
15、在一些实施例中，ppcala的核苷酸序列如seq id no.11所示；sscala的核苷酸序列如seq id no.12所示。
16、在一些实施例中，松柏醛脱氢酶包括abcalb和xtcalb；abcalb的氨基酸序列如seqid n本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中包括编码香草醇氧化酶和氧化还原酶的基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中还包括编码O-脱甲基酶的基因。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述氧化还原酶包括醇类氧化还原酶和醛类氧化还原酶；
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述O-脱甲基酶具有SEQ IDNO.1-2所示的氨基酸序列；
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述O-脱甲基酶具有SEQ IDNO.3-4所示的核苷酸序列；
6.根据权利要求1-5任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主为大肠杆菌；
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有表达载体，所述表达载体包括pCDFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。
8.如权利要求7所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法选自如下(1)或(2)中的任意一种：
9.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有
10.如权利要求1-7任一项所述的基因工程菌在生产肉桂酸及其衍生物中的应用，其特征在于，将权利要求1-7任一项所述的基因工程菌加入含底物的溶液中进行全细胞转化，获得目标产物；所述底物为苯丙烯及其衍生物中的至少一种；
...【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中包括编码香草醇氧化酶和氧化还原酶的基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中还包括编码o-脱甲基酶的基因。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述氧化还原酶包括醇类氧化还原酶和醛类氧化还原酶；
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述o-脱甲基酶具有seq idno.1-2所示的氨基酸序列；
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述o-脱甲基酶具有seq idno.3-4所示的核苷酸序列；
6.根据权利要求1-5任一项所述的基因工程菌，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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