【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体而言，涉及一种重组菌及其在合成3,4-二羟基苯乙胺中的应用。
技术介绍
1、3,4-二羟基苯乙胺，又名多巴胺，是去甲肾上腺素及肾上腺素的合成前体，可作为神经递质调控中枢神经系统的多种生理功能，也可作为急救药，用于临床各种类型休克治疗，此外，随着材料表面工程在电子及生物医学领域的应用，3,4-二羟基苯乙胺也被用于物质的表面修饰。
2、目前，国内外学者报道了多种3,4-二羟基苯乙胺的生物法制备路线，例如aruangshu等通过大肠杆菌表达源于猪肾细胞的多巴脱羧酶(ddc)及源于大肠杆菌的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶(hpabc)，转化l-酪氨酸制备3,4-二羟基苯乙胺，经24h摇瓶转化，获得的3,4-二羟基苯乙胺最大浓度达27mg/l。例如akira等以甘油为碳源，通过大肠杆菌发酵转化制备3,4-二羟基苯乙胺，经90h的发酵，共消耗90g/l的甘油，获得的3,4-二羟基苯乙胺产量约为2.15g/l，产率为3.8％。
3、现有技术中，3,4-二羟基苯乙胺制备路线普遍具有生产效率低、产量低、成本高等缺点，因此，创建一条效率较高的3,4-二羟基苯乙胺制备方法迫在眉睫。
4、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种重组菌及其在合成3,4-二羟基苯乙胺中的应用，该重组菌可作为生物催化剂将底物丁香酚和l-丙氨酸转化为3,4-二羟基苯乙胺。
2、本专利技术是这样实现的：
3、第一方面，
4、其中，o-脱甲基酶包括ssodem和smodem；ssodem的氨基酸序列如seq id no.1所示，smodem的氨基酸序列如seq id no.2所示；
5、加氧酶包括cscoo和bscoo；cscoo的氨基酸序列如seq id no.3所示，bscoo的氨基酸序列如seq id no.4所示；
6、转氨酶包括psate和scate；psate的氨基酸序列如seq id no.5所示，scate的氨基酸序列如seq id no.6所示。
7、本专利技术设计了一条以丁香酚和l-丙氨酸为原料，利用全细胞转化法合成3,4-二羟基苯乙胺的新路线，首先通过o-脱甲基酶催化丁香酚反应生成4-烯丙基儿茶酚，随后利用加氧酶催化4-烯丙基儿茶酚和fe2+生成3,4-二羟基苯乙醛，最终利用转氨酶催化3,4-二羟基苯乙醛和l-丙氨酸生成3,4-二羟基苯乙胺，在此过程中，所需辅酶由菌体代谢葡萄糖来提供。具体的合成路线如图1所示。
8、在一些实施例中，上述o-脱甲基酶ssodem源自sphingobium sp.，genbank编号bbd02022.1，其氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.7所示。
9、在一些实施例中，上述o-脱甲基酶smodem源自stenotrophomonas maltophilia，genbank编号aav53699.1，其氨基酸序列如seq id no.2所示，核苷酸序列如seq id no.8所示。
10、专利技术人在获得o-脱甲基酶ssodem和smodem的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
11、在一些实施例中，上述加氧酶cscoo源自caulobacter segnis，genbank编号adg12013.1，其氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.9所示。
12、在一些实施例中，上述加氧酶bscoo源自burkholderia sp.，genbank编号asl46149.1，其氨基酸序列如seq id no.4所示，核苷酸序列如seq id no.10所示。
13、专利技术人在获得加氧酶cscoo和bscoo的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
14、在一些实施例中，上述转氨酶psate源自pseudomonas，genbank编号wp_012722053.1，其氨基酸序列如seq id no.5所示，核苷酸序列如seq id no.11所示。
15、在一些实施例中，上述转氨酶psate源自saccharomyces cerevisiae，genbank编号daa12410.1，其氨基酸序列如seq id no.6所示，核苷酸序列如seq id no.12所示。
16、专利技术人在获得转氨酶psate和psate的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
17、在一些实施例中，上述重组菌的构建方法为：将o-脱甲基酶、加氧酶和转氨酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至宿主菌株中，即获得上述重组菌。
18、在一些实施例中，上述表达载体包括pet28a(+)质粒和pcdfduet-1质粒。
19、在一些实施例中，上述重组菌的宿主为大肠杆菌。在其他实施方式中，重组菌的宿主可以是其他细菌，本专利技术不对其进行具体的限定。
20、在一些实施例中，上述大肠杆菌包括escherichia coli bl21(de3)、escherichiacoli dh5α、escherichia coli xl-blue。
21、本专利技术重组的大肠杆菌通过双质粒共表达3个酶的编码基因，可选地，pet28a(+)装载o-脱甲基酶，pcdfduet-1装载加氧酶及转氨酶，然后将两个重组质粒转化到宿主菌株，得到重组菌。
22、第二方面，本专利技术提供了一种全细胞催化剂，其含有上述的重组菌。
23、第三方面，本专利技术提供了一种核酸分子，其编码具有将丁香酚和l-丙氨酸转化为3,4-二羟基苯乙胺功能的蛋白，上述核酸分子包括编码o-脱甲基酶、加氧酶和转氨酶的基因；
24、其中o-脱甲基酶包括ssodem和smodem；ssodem的核苷酸序列如seq id no.7所示，smodem的核苷酸序列如seq id no.8所示；
25、加氧酶包括cscoo和bscoo；cscoo的核苷酸序列如seq id no.9所示，bscoo的核苷酸序列如seq id no.10所示；
26、转氨酶包括psate和scate；psate的核苷酸序列如seq id no.11所示，scate的核苷酸序列如seq id no.12所示。
27、第四方面，本专利技术提供了一种表达载体，该表达载体携带上述核酸分子。
28、第五方面，本专利技术提供了含有上述核酸分子或表达载体的微生物细胞。
29、第六方面，本专利技术提供了上述重组菌、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合成3,4-二羟基苯乙胺的重组菌，其特征在于，所述重组菌包含编码O-脱甲基酶、加氧酶和转氨酶的基因。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述O-脱甲基酶包括SsOdem和SmOdem；所述SsOdem的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SmOdem的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将丁香酚和L-丙氨酸转化为3,4-二羟基苯乙胺功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码O-脱甲基酶、加氧酶和转氨酶的基因；
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
7.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3所述的全细胞催化剂，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的微生物细胞在合成3,4-二羟基苯乙胺及其下游产物中的应用。
8.一种合成3,4-二羟基
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系中包括：丁香酚1-50g/L，L-丙氨酸1-70g/L，葡萄糖10-80g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，重组菌体量1-20g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
...【技术特征摘要】
1.一种合成3,4-二羟基苯乙胺的重组菌，其特征在于，所述重组菌包含编码o-脱甲基酶、加氧酶和转氨酶的基因。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述o-脱甲基酶包括ssodem和smodem；所述ssodem的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述smodem的氨基酸序列如seq id no.2所示；
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将丁香酚和l-丙氨酸转化为3,4-二羟基苯乙胺功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码o-脱甲基酶、加氧酶和转氨酶的基因；
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
【专利技术属性】
技术研发人员：秦勇，杨波，张炜，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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