【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，具体而言，涉及一种生产3,4-二羟基苯乙酸的方法。
技术介绍
1、3,4-二羟基苯乙酸，又称高原儿茶酸，是一种天然存在的酚酸，具有很强的自由基清除活性，它能够减少脂质过度氧化，可作为一种天然的抗氧化剂，也具有抗菌、抗病毒、保肝、治疗中枢神经性疾病、抑制环氧酶及酯氧酶等生理活性。
2、3,4-二羟基苯乙酸的制备方法主要有植物提取法、化学合成法及生物转化法。提取法的效率较低、成本高，阻碍了其大规模应用。化学合成法具有副产物多、步骤繁琐、产物光学纯度低等缺陷，不适合工业化生产。生物转化法具备特异性高、绿色环保、反应条件温和及无需多步分离纯化等优点，目前已经受到了广泛的关注。
3、目前，国内外学者报道了多种3,4-二羟基苯乙酸的生物法制备路线，xianglai li等对大肠杆菌合成3,4-二羟基苯乙酸的代谢路径进行改造，以葡萄糖为底物，通过工程菌发酵制备3,4-二羟基苯乙酸，最高可以获得1.9g/l的3,4-二羟基苯乙酸；pierre等以酪醇为底物，通过菌halomonassp.代谢转化制备3,4-二羟基苯乙酸，最高可获得0.9g/l的3,4-二羟基苯乙酸；markus等通过固定化蘑菇酪氨酸酶转化对羟基苯乙酸制备3,4-二羟基苯乙酸，以5mm对羟基苯乙酸为底物，3,4-二羟基苯乙酸的最高产率仅为52％。
4、以上报道的3,4-二羟基苯乙酸生物合成路线具有产物产量低，产率低，生产效率低，底物成本高，辅酶再生效率低等缺点，因此，创建一条效率高、成本低的3,4-二羟基苯乙酸制备方法迫
5、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种生产3,4-二羟基苯乙酸的方法，该方法是利用重组菌以阿魏酸为底物制备3,4-二羟基苯乙酸，通过该方法可以改善现有技术中存在的生产效率低，底物成本高等问题。
2、本专利技术生产3,4-二羟基苯乙酸的具体路线为：通过阿魏酸脱羧酶(fdc)将阿魏酸转化为4-乙烯愈疮木酚，通过苯乙烯单加氧酶(smo)将4-乙烯愈疮木酚转化为2-甲氧基-4-(环氧乙烷基)苯酚，通过环氧化物水解酶(eh)将2-甲氧基-4-(环氧乙烷基)苯酚转化为4-羟基-3-甲氧基苯乙二醇，通过丙二醇脱水酶(pdh)将4-羟基-3-甲氧基苯乙二醇转化为4-羟基-3-甲氧基苯乙醛，通过乙醛脱氢酶(aldh)将4-羟基-3-甲氧基苯乙醛转化为4-羟基-3-甲氧基苯乙酸，在o-脱甲基酶(o-demethylases)的作用下生成3,4-二羟基苯乙酸，反应过程中所需辅酶由菌体代谢葡萄糖来提供，图1为上述生产方法的路线图。
3、上述合成方式是通过构建重组菌表达fdc、smo、eh、pdh、aldh和o-脱甲基酶，再将其作为催化剂进行全细胞转化合成3,4-二羟基苯乙酸。
4、本专利技术是这样实现的：
5、第一方面，本专利技术提供了一种生产3,4-二羟基苯乙酸的重组菌，该重组菌表达fdc、smo、eh、pdh、aldh和o-脱甲基酶。
6、其中，fdc包括lhfdc和scfdc，lhfdc来源于lachnellula hyalina，genbank编号xp_031002879.1，其核苷酸序列如seq id no.13所示，氨基酸序列如seq id no.1所示；scfdc来源于saccharomyces cerevisiae，genbank编号daa12368.1，其核苷酸序列如seqid no.14所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。
7、smo包括mssmo和rosmo，mssmo来源于metabacillus sediminilitoris，genbank编号qgq48014.1，其核苷酸序列如seq id no.15所示，氨基酸序列如seq id no.3所示；rosmo来源于rhodococcus opacus，genbank编号aii82583.1，其核苷酸序列如seq id no.16所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。
8、eh包括sceh和aveh；sceh来源于saccharomyces cerevisiae，genbank编号np_014462.1，其核苷酸序列如seq id no.17所示，氨基酸序列如seq id no.5所示；aveh来源于actinomadura verrucosospora，genbank编号qkg19196.1，其核苷酸序列如seq idno.18所示，氨基酸序列如seq id no.6所示。
9、pdh包括kppdh和mgpdh；kppdh来源于klebsiella pneumoniae，genbank编号ovj26004.1，其核苷酸序列如seq id no.19所示，氨基酸序列如seq id no.7所示；mgpdh来源于mycolicibacterium goodii，genbank编号aks36059.1，其核苷酸序列如seq id no.20所示，氨基酸序列如seq id no.8所示。
10、aldh包括pdaldh和cpaldh；pdaldh来源于paracoccus denitrificans，genbank编号abl70456.1，其核苷酸序列如seq id no.21所示，氨基酸序列如seq id no.9所示；cpaldh来源于craterostigma plantagineum，genbank编号cac84900.1，其核苷酸序列如seq id no.22所示，氨基酸序列如seq id no.10所示。
11、o-脱甲基酶包括spodem和smodem；spodem来源于sphingomonas paucimobilis，genbank编号bad61059.1，其核苷酸序列如seq id no.23所示，氨基酸序列如seq id no.11所示；smodem来源于stenotrophomonas maltophilia，genbank编号aav53699.1，其核苷酸序列如seq id no.24所示，氨基酸序列如seq id no.12所示。
12、专利技术人在获得上述酶的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
13、在一些实施例中，上述重组菌的构建方法包括：将fdc、smo、eh、pdh、aldh和o-脱甲基酶的基因连接到双启动子表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌株中，即获得重组菌。
14、在一些实施例中，重组菌的出发菌株为大肠杆菌。在其他实施方式中，重组菌的出发菌株可以是其他细菌，本专利技术不对其进行具体的限定。
15、在一些实施例中，大肠杆菌选自escherichia colibl21(de3)、escherichiacolidh5α和escherichiacolixl-blue中的任意一种。
16、在一些实施例中，双启动子表达载本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合成3,4-二羟基苯乙酸的重组菌，其特征在于，包含编码阿魏酸脱羧酶、苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、丙二醇脱水酶、乙醛脱氢酶和O-脱甲基酶的基因。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述阿魏酸脱羧酶包括LhFDC和ScFDC；所述LhFDC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ScFDC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将阿魏酸转化为3,4-二羟基苯乙酸功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码阿魏酸脱羧酶、苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、丙二醇脱水酶、乙醛脱氢酶和O-脱甲基酶的基因；
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
7.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3所述的全细胞催化剂，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的微生物细胞在合成
8.一种合成3,4-二羟基苯乙酸的方法，其特征在于，其包括将权利要求1或2所述的重组菌加入含有阿魏酸的溶液中进行全细胞催化，获得3,4-二羟基苯乙酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系中包括：阿魏酸1-50g/L，葡萄糖5-80g/L，重组菌体量1-20g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为10-24h。
...【技术特征摘要】
1.一种合成3,4-二羟基苯乙酸的重组菌，其特征在于，包含编码阿魏酸脱羧酶、苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、丙二醇脱水酶、乙醛脱氢酶和o-脱甲基酶的基因。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述阿魏酸脱羧酶包括lhfdc和scfdc；所述lhfdc的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述scfdc的氨基酸序列如seq id no.2所示；
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将阿魏酸转化为3,4-二羟基苯乙酸功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码阿魏酸脱羧酶、苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、丙二醇脱水酶、乙醛脱氢酶和o-脱甲基酶的基因；
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：秦勇，杨波，张炜，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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