【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因的构建及用途。
技术介绍
1、针对cd19(抗cd19car-t)的嵌合抗原受体t细胞在治疗复发/难治性b系急性淋巴细胞白血病(r/r b-all)和淋巴瘤方面表现出良好的治疗效果，儿童和年轻成人的缓解率为60-83％。然而，与car-t相关的不良事件，如严重细胞因子释放综合征(crs)，免疫细胞相关神经毒性综合征(icans)等，对接受抗cd19car-t细胞疗法的病人构成了巨大的威胁。
2、cd19car-t靶向治疗期间的crs发病率为77-81％，其中严重crs占22％。严重crs的临床表现包括持续性高烧、持续性低血压、呼吸功能障碍和最终可能发生多器官功能衰竭。
3、目前，妥珠抗体(tocilizumab)和糖皮质激素仍然是治疗crs的主要方法。然而，临床上严重crs的处理仍然具有挑战性，且大剂量糖皮质激素的使用能显著抑制car-t细胞增殖及杀肿瘤活性，影响car-t细胞的疗效，因此开发新的治疗方法迫在眉睫。
技术实现思路
1、1.要解决的技术问题
2、本专利技术的目的是为了解决现有技术中临床上严重crs的处理仍然具有挑战性，且大剂量糖皮质激素的使用能显著抑制car-t细胞增殖及杀肿瘤活性，影响car-t细胞疗效的问题，而提出的敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因的构建及用途将能解决其临床应用的安全问题。
3、2.技术方案
4、为了实现上
5、敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因，包括t细胞，所述t细胞为ifn-γkdcd19car-t。
6、本专利技术中还提出了敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因的构建方法，包括以下步骤：
7、步骤1：细胞的采集，获取cd19阳性的急性b系淋巴细胞白血病细胞系nalm-6即nalm-6cd19pos和人血管内皮细胞ea.hy926，并通过cd19car-t细胞与nalm-6cd19pos共培养筛选得到nalm-6cd19neg细胞系；
8、步骤2：car结构设计，通过基因重组技术，将ifn-γshrna序列编码的dna寡核苷酸插入载体，针对shrna序列设计了两种引物，引物序列为：shifn-γ-1st(trcn0000058499)
9、cgcattcagatgtagcggataatctcgagattatccgctacatctgaatgtttttttt；
10、shifn-γ-2nd(trcn0000058500)
11、cggcagagccaaattgtctctcttctcgagaaggagagacaatttggctctgctttttt；这些引物退火后会产生一段较短的dna片段，在u6启动子的控制下，将shifn-γ克隆到慢病毒载体plvx中，以获得表达shifn-γ的克隆；采用来自fmc63的cd19杂交瘤克隆的cd19抗体基因可变区单链片段cd19scfv，anti-cd19scfv序列与cd8a铰链区、cd8a跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域和cd3ζ信号转导结构域连接，形成cd19car盒；cd19car盒被分别亚克隆到plvx载体或shifn-γ-plvx载体的xbai和sali裂解位点，并分别命名为plvx/anti-cd19car质粒和plvx/shifn-γ-anti-cd19car质粒；
12、步骤3：shifn-γ-anti-cd19car-t细胞培养，将pax2载体、pmd.2g载体和plvx/anti-cd19car或plvx/shifn-γ-抗-cd19car按一定的分子比混合，共转染人胚肾293t细胞(hek293t)；转染48小时后，收集并浓缩上清液，得到anti-cd19car或shifn-γ-anti-cd19car慢病毒，将其冷冻在-80℃冰箱中，以备后续实验用；
13、通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(pbmcs)，并用texmacs培养基培养，细胞在37℃、5％co2条件下孵育48小时后，加入感染倍率moi为5的浓缩慢病毒，同时加入5μg/ml聚凝胺并混合均匀；
14、将混合物在37℃和5％co2条件下持续培养24小时，然后以500g离心5分钟，并用含有il-2的新鲜x-vivo培养基，每隔2-3天换液一次，细胞密度保持在约1×106个细胞/ml，并再扩增约7-10天。
15、所述步骤1中nalm-6cd19pos、nalm-6cd19neg和ea.hy926细胞均在37℃、5％co2条件下，在含10％胎牛血清的rpmi 1640培养液中培养，或在液氮中冷冻保存。
16、所述步骤2中靶向ifn-γ的shrna序列来自sigma-aldrich中国网站
17、所述pax2载体、pmd.2g载体和plvx/anti-cd19car或plvx/shifn-γ-抗-cd19car的混合分子比为2:1:2。
18、所述步骤3中培养基中添加t细胞活化剂transact cd3/cd2850ng/ml(德国miltenyi biotec公司)和人il-2200单位/ml(德国miltenyi biotec公司)以激活t细胞。
19、本专利技术中还提出了敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因及其car-t细胞在临床cd19抗原阳性的b细胞肿瘤靶向治疗中的应用。
20、本专利技术中还提出了敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因及其car-t细胞在临床cd19阳性b细胞肿瘤缓解后预防复发中的应用。
21、本专利技术中还提出了敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因及其car-t细胞用于良性b细胞相关自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、难治性自身免疫性溶血性贫血、难治性免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血合并自身免疫性血小板减少症等疾病的治疗。
22、3.有益效果
23、相比于现有技术，本专利技术的优点在于：
24、(1)本专利技术中，shifn-γ-anti-cd19car-t细胞在不显著影响car-t靶向杀伤功能的情况下减少car-t在治疗复发/难治性b系急性淋巴细胞白血病(r/r b-all)和淋巴瘤时产生的细胞因子风暴(crs)等毒副作用。
25、(2)本专利技术中，shifn-γ-anti-cd19car-t细胞能抑制pbmc释放各种细胞因子，同时保持抗cd19car-t对cd19+恶性和正常b细胞的有效性，从而减少抗cd19car-t细胞治疗过程中的毒性反应。
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1.敲低干扰素γ的抗人CD19嵌合抗原受体基因，包括T细胞，其特征在于，所述T细胞为IFN-γKDCD19CAR-T。
2.根据权利要求1所述的敲低干扰素γ的抗人CD19嵌合抗原受体基因的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的敲低干扰素γ的抗人CD19嵌合抗原受体基因的构建方法，其特征在于，所述步骤1中Nalm-6CD19pos、Nalm-6CD19neg和EA.hy926细胞均在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中和37℃、5％CO2条件下培养，或在液氮中冷冻保存。
4.根据权利要求2所述的敲低干扰素γ的抗人CD19嵌合抗原受体基因的构建方法，其特征在于，所述步骤2中靶向IFN-γ的shRNA序列来自Sigma-Aldrich中国网站shRNA。
5.根据权利要求2所述的敲低干扰素γ的抗人CD19嵌合抗原受体基因的构建方法，其特征在于，所述pAX2载体、pMD.2G载体和PLVX/anti-CD19CAR或PLVX/shIFN-γ-抗-CD19CAR的混合分子比为2:1:2。
6.根据权利
7.根据权利要求1所述的敲低干扰素γ的抗人CD19嵌合抗原受体基因的用途，其特征在于，所述基因在临床CD19抗原阳性的B细胞肿瘤靶向治疗中的应用。
8.根据权利要求1所述的敲低干扰素γ的抗人CD19嵌合抗原受体基因的构建及用途，其特征在于，所述基因在临床CD19阳性B细胞肿瘤缓解后预防复发中的应用。
9.根据权利要求1所述的敲低干扰素γ的抗人CD19嵌合抗原受体基因的构建及用途，其特征在于，所述基因用于良性B细胞相关自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、难治性自身免疫性溶血性贫血、难治性免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血合并自身免疫性血小板减少症等疾病的治疗。
...【技术特征摘要】
1.敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因，包括t细胞，其特征在于，所述t细胞为ifn-γkdcd19car-t。
2.根据权利要求1所述的敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因的构建方法，其特征在于，所述步骤1中nalm-6cd19pos、nalm-6cd19neg和ea.hy926细胞均在含10％胎牛血清的rpmi1640培养液中和37℃、5％co2条件下培养，或在液氮中冷冻保存。
4.根据权利要求2所述的敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因的构建方法，其特征在于，所述步骤2中靶向ifn-γ的shrna序列来自sigma-aldrich中国网站shrna。
5.根据权利要求2所述的敲低干扰素γ的抗人cd19嵌合抗原受体基因的构建方法，其特征在于，所述pax2载体、pmd.2g载体和plvx/anti-cd19car或plvx/shifn-γ-抗-cd19car的混...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤永民，汤扬，钦敏燕，严诗卉，杨圣丽，
申请(专利权)人：杭州永申生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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