【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体而言，涉及一种酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶sur2的突变体及其应用。
技术介绍
1、神经酰胺作为一类鞘脂代谢产物，是构成细胞膜和细胞器膜的重要组分。神经酰胺存在于所有的真核细胞中，它对细胞分化、增殖、凋亡、衰老等生命活动都具有重要的调节作用。神经酰胺是人体中的固有组分，起到很好的皮肤屏障功能。既能防止有害物质入侵，又能隔绝皮肤中的水分流失。
2、随着护肤品成分的增多，用来保湿抗衰老的神经酰胺越来越火，全球神经酰胺市场稳步增长。目前，用于化妆品中的神经酰胺制品主要从植物中提取。但该方法受植物生长周期及环境限制，产量较低，且在工业水平上显然成本很高。而化学合成则步骤繁琐，副产物多，合成效率低，对环境十分不利，难以实现工业化生产。研究发现酿酒酵母可以直接产生神经酰胺，但产量较低。
3、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶sur2的突变体及其应用，该突变体是通过易错pcr等诱变技术改造酶的基因，然后根据特定的改造目的，并筛选获得的，利用该突变体可以高效生产神经酰胺。
2、本专利技术是这样实现的：
3、第一方面，本专利技术提供了一种酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶sur2的突变体，其由氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶发生突变得到，其中，突变的方式为如下(1)-(7)中的任意一种或几种的组合：
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5、(2)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶的氨基酸序列中第127位的f突变为y；
6、(3)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶的氨基酸序列中第124位的m突变为l；
7、(4)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶的氨基酸序列中第152位的y突变为f；
8、(5)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶的氨基酸序列中第121位的p突变为i；
9、(6)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶的氨基酸序列中第123位的y突变为m；
10、(7)将所述野生型酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶的氨基酸序列中第224位的m突变为k。
11、酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶(yeast sphinganine c4-hydroxylase gene，sur2)存在于酵母中。本专利技术通过对野生型sur2突变，得到上述的sur2突变体，该突变体能够用于合成神经酰胺。
12、seq id no.1所示的氨基酸序列为酿酒酵母来源的sur2基因，其他来源的野生型sur2经过上述突变方式(1)-(7)中的任意一种或几种的组合得到的sur2突变体均可用于合成神经酰胺。
13、本专利技术中，氨基酸序列指构成蛋白质或多肽的氨基酸残基的种类以及排列方式，通常用本领域常规使用的三字母方式表示氨基酸残基，也可使用本领域常规使用的单字母方式表示氨基酸残基，本领域技术人员应当能够将三字母构成氨基酸序列与单字母构成的氨基酸序列进行转换。应当明确的是，无论本专利技术中采用哪种方式表示，本领域技术人员均能够理解以及转换。例如：丙氨酸，单字母为a，三字母为ala；精氨酸，单字母为r，三字母为arg；天冬氨酸，单字母为d，三字母为asp；半胱氨酸，单字母为c，三字母为cys；谷氨酰胺，单字母为q，三字母为gln；谷氨酸，单字母为e，三字母为glu；组氨酸，单字母为h，三字母为his；异亮氨酸，单字母为i，三字母为ile；甘氨酸，单字母为g，三字母为gly；天冬酰胺，单字母为n，三字母为asn；亮氨酸，单字母为l，三字母为leu；赖氨酸，单字母为k，三字母为lys；甲硫氨酸，单字母为m，三字母为met；苯丙氨酸，单字母为f，三字母为phe；脯氨酸，单字母为p，三字母为pro；丝氨酸，单字母为s，三字母为ser；苏氨酸，单字母为t，三字母为thr；色氨酸，单字母为w，三字母为trp；酪氨酸，单字母为y，三字母为tyr；缬氨酸，单字母为v，三字母为val。
14、在一些实施例中，sur2突变体的突变方式为：
15、如seq id no.1所示的氨基酸序列中第153位的m突变为i，该突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示；或
16、如seq id no.1所示的氨基酸序列中第153位的m突变为i、第124位的m突变为l，该突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示；或
17、如seq id no.1所示的氨基酸序列中第153位的m突变为l、第152位的y突变为f，该突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示；或
18、如seq id no.1所示的氨基酸序列中第153位的m突变为y、第123位的y突变为m以及第224位的m突变为k，该突变体的氨基酸序列如seq id no.5所示；或
19、如seq id no.1所示的氨基酸序列中第127位的f突变为y，该突变体的氨基酸序列如seq id no.6所示；或
20、如seq id no.1所示的氨基酸序列中第127位的f突变为y、第121为的p突变为i，该突变体的氨基酸序列如seq id no.7所示。
21、也即是，本专利技术的突变体的氨基酸突变为m153i或m153i/m124l或m153l/y152f或f127y或f127y/p121i或m153y/y123m/m224k。
22、第二方面，本专利技术提供了上述突变体的筛选方法，其包括：利用易错pcr技术在体外向sur2基因引入核苷酸突变，通过多轮重组和随机突变，经定向进化获得目标突变体。
23、具体地，该筛选方法为：
24、(1)将易错pcr扩增产物经dna纯化试剂盒纯化后，与经限制性内切酶bamhi和hindiii消化后的pesc-ura质粒进行连接，采用醋酸锂转化法转化至酿酒酵母感受态细胞；涂布于尿嘧啶营养缺陷固体培养基sd-ura平板，25～30℃倒置培养2-5d。
25、(2)利用步骤(1)的方法，以突变体基因为模板进行多轮易错pcr，构建突变文库。
26、(3)sur2突变文库筛选：
27、将sd-ura平板上长出的转化子接到sd-ura液体培养基的96孔深孔板中，25～30℃，180～200rpm培养18～24h，将菌液转接至含有诱导培养基的96孔深孔板中，同时接入野生型酿酒酵母作为对照，25～30℃，600～800rpm摇床中培养2～3d，取诱导表达2～3天的发酵液，萃取神经酰胺后分析其产量，选择相同条件下神经酰胺产量明显比野生型酿酒酵母产量高的菌株为目的菌株。
28、(4)摇瓶复筛优势突变株：
29、将高产神经酰胺的酿酒酵母菌株从母板中蘸取菌落划线于sd-ura平板，将其倒置放本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶SUR2的突变体，其特征在于，所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶发生突变得到，其中，突变的方式为如下(1)-(7)中的任意一种或几种的组合：
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的突变方式为：
3.权利要求1或2所述突变体的筛选方法，其特征在于，利用易错PCR技术在体外向野生型酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因引入核苷酸突变，通过重组和随机突变，经定向进化获得目标突变体。
4.编码权利要求1或2所述突变体的核酸分子。
5.含有权利要求3所述核酸分子的表达载体。
6.重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求3所述核酸分子通过质粒导入宿主菌中或通过基因工程手段整合到宿主菌染色体上构建得到的；
7.含有权利要求6所述的重组菌的细胞催化剂。
8.权利要求1或2所述突变体或权利要求5所述表达载体或权利要求6所述重组菌或权利要求7所述的细胞催化剂在神经酰胺生产中的应用。
9.一种高效合成
10.根据权利要求9所述的高效合成神经酰胺的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系中包括：葡萄糖5-15g/L，半乳糖15-25g/L，酵母粉1-10g/L，蛋白胨5-15g/L，α-环糊精10-20g/L，CaCl2 0.5-1.0g/L，NH4SO4 0.5-1.0g/L，KH2PO4 0.5-1.0g/L，MgSO4 0.1-0.5g/L，FeSO4 7H2O 0.01-0.05g/L，烟酸10-50mg/L，重组菌体量1-20g/L；
...【技术特征摘要】
1.一种酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶sur2的突变体，其特征在于，所述突变体由氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶发生突变得到，其中，突变的方式为如下(1)-(7)中的任意一种或几种的组合：
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的突变方式为：
3.权利要求1或2所述突变体的筛选方法，其特征在于，利用易错pcr技术在体外向野生型酵母二氢神经鞘氨醇c4-羟化酶基因引入核苷酸突变，通过重组和随机突变，经定向进化获得目标突变体。
4.编码权利要求1或2所述突变体的核酸分子。
5.含有权利要求3所述核酸分子的表达载体。
6.重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求3所述核酸分子通过质粒导入宿主菌中或通过基因工程手段整合到宿主菌染色体上构建得到的；
<...【专利技术属性】
技术研发人员：于大禹，孙磊，张炜，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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