本发明专利技术公开了一种生产反式3‑甲氧基‑4‑羟基肉桂酸的方法，该方法是通过构建能够表达酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸解氨酶的基因工程菌，再经过全细胞转化，催化愈创木酚、丙酮酸及氨生成反式3‑甲氧基‑4‑羟基肉桂酸。本发明专利技术中选择的底物来源广、制备过程简单，且价格低廉，是理想的底物；同时本发明专利技术选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，因此，利用本发明专利技术的重组菌转化生产反式3‑甲氧基‑4‑羟基肉桂酸，其生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体而言，涉及一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的方法。
技术介绍
1、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，又称为阿魏酸，属于肉桂酸的衍生物，在植物体内普遍存在，尤其在阿魏、川芎、当归等中药材中含量较高。3-甲氧基-4-羟基肉桂酸分为顺式及反式两种类型，其中反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸能清除自由基，并抑制酪氨酸酶活性，调节人体生理功能，广泛应用于医药、农药、保健品、化妆品原料及食品添加剂中，具有较高的经济价值。
2、反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的制备方法主要有提取法、化学合成法及生物转化法。提取法主要以米糠油来源的谷维素为原料，经处理提取获得反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，但是，提取步骤复杂、成本高，限制了这种方法的工业化应用。化学合成法主要以香兰素为基本原料，合成过程中会产生较多的副产物，收率低且分离纯化成本高，阻碍了其大规模应用。
3、目前中国专利cn104818300中公开的反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的生物法制备路线为：通过咖啡酸-o甲基转移酶将s-腺苷甲硫氨酸的甲基转移至咖啡酸，从而获得反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，最高产量低于0.1g/l，而且以价格较为昂贵的咖啡酸为原料，生产成本高。
4、以上报道的反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸生物合成路线具有生产效率低，底物成本高等缺点，因此，提供一种新的效率高、成本低的反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸制备方法是具有积极意义的。
5、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路</p>1、本专利技术的目的在于提供一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的方法，该方法是通过构建能够表达酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸解氨酶的基因工程菌，再经过全细胞转化，催化愈创木酚、丙酮酸及氨生成反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，该方法效率高、成本低，具有良好的工业化应用前景。
2、本专利技术是这样实现的：
3、首先，本专利技术提供了一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的工程菌，该工程菌包含酪氨酸酚裂解酶(tpl)和酪氨酸解氨酶(tal)的编码基因；其能够表达酪氨酸酚裂解酶(tpl)和酪氨酸解氨酶(tal)。
4、在本专利技术中，构建工程菌的出发菌株包括大肠杆菌，具体可以是escherichiacoli bl21(de3)、escherichia coli dh5α、escherichia coli xl-blue中任意一种。
5、为了获得生产效率更高的工程菌，本专利技术对tpl和tal进行了筛选，其中tpl包括：来源于成团泛菌(pantoea agglomerans)，其genbank编号为aab24234.1的patpl；来源于多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida)，其编号为genbank编号qto71434.1的pmtpl；和来源于摩氏摩根菌(morganella morganii)，其genbank编号为qsb63600.1)的mmtpl。
6、tal包括：来源于豚鼠耳炎诺卡菌(nocardia otitidiscaviarum)，其genbank编号为sua81314.1的notal；来源于西宫皮肤球菌(dermacoccus nishinomiyaensis)，其genbank编号为cag9180269.1的cptal；和来源于cupriavidus pampae，其genbank编号为std15818.1的dntal。
7、专利技术人在获得上述tpl和tal的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成以下优化后的核苷酸序列。
8、具体地，patpl的氨基酸序列如seq id no.1所示，其核苷酸序列如seq id no.4所示。
9、pmtpl的氨基酸序列如seq id no.2所示，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
10、mmtpl的氨基酸序列如seq id no.3所示，其核苷酸序列如seq id no.6所示。
11、notal的氨基酸序列如seq id no.7所示，其核苷酸序列如seq id no.10所示。
12、cptal的氨基酸序列如seq id no.8所示，其核苷酸序列如seq id no.11所示。
13、dntal的氨基酸序列如seq id no.9所示，其核苷酸序列如seq id no.12所示。
14、在一些实施例中，上述工程菌的构建方法包括：将tpl和tal的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌株中，即获得工程菌。
15、在一些实施例中，上述表达载体包括pcdfduet-1质粒和pacycduet-1质粒。
16、在本专利技术中，在上述tpl和tal中各选一个酶，分别装载在pcdfduet-1质粒和pacycduet-1质粒上。较为优选地，pcdfduet-1装载tpl，pacycduet-1装载tal。
17、通过上述方法构建的工程菌，其能够表达tpl和tal，利用该工程菌可以合成反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，其具体合成路线为：通过tpl将愈创木酚、丙酮酸及氨转化为4-羟基-3-甲氧基苯丙氨酸，通过tal将4-羟基-3-甲氧基苯丙氨酸转化为反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，如图1所示。
18、因此，本专利技术在上述内容的基础上还提供了一种反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的生产方法，该方法是将上述基因工程菌加入含有愈创木酚、丙酮酸和氨的溶液中进行催化，获得反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸。
19、在一些实施例中，上述工程菌通过全细胞转化合成反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，在进行全细胞转化前对基因工程菌进行诱导培养，该诱导培养过程为：将基因工程菌接种至含30-60mg/l氯霉素和30-60mg/l链霉素的lb培养基中，培养后获得种子液，然后将种子液接种至新鲜的lb培养基中，至菌浓od600nm达0.6-0.8，添加诱导剂，诱导后分离、清洗即得湿菌体。
20、在一些实施例中，上述基因工程菌的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm，培养时间为10-16h。
21、在一些实施例中，上述种子液的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm。
22、在一些实施例中，上述诱导条件为：诱导剂0.2-0.6mm iptg，温度为25-30℃，时间为10-16h。
23、在一些实施例中，全细胞转化的生产体系中包括：愈创木酚1-20g/l，丙酮酸1-15g/l，醋酸铵3-40g/l，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/l，工程菌体量1-50g/l。
24、在一些实施例中，全细胞催化的生产体系的ph为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
25、本专利技术具有以下有益效果：
26、本专利技术通过在大肠杆菌中导入外源的酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸解氨本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌包含酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸解氨酶的编码基因。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶的编码基因来源于成团泛菌(Pantoea agglomerans)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)或摩氏摩根菌(Morganella morganii)；所述酪氨酸解氨酶的编码基因来源于豚鼠耳炎诺卡菌(Nocardia otitidiscaviarum)、西宫皮肤球菌(Dermacoccus nishinomiyaensis)或Cupriavidus pampae。
3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示；
4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQID NO.7-SEQ ID NO.9所示；
5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的出发菌株包括Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli XL-Blue。
6.如权利要1-5任一项所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括：将所述酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸解氨酶的编码基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌株中，即获得所述工程菌；
7.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1-6任一项所述的工程菌。
8.权利要求1-6任一项所述的工程菌或权利要求7所述的全细胞催化剂在合成反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸及其下游产物中的应用。
9.一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的方法，其特征在于，以愈创木酚、丙酮酸和氨为底物，利用权利要求1-6任一项所述的工程菌进行全细胞催化，获得反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸。
10.根据权利要求9所述的生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述全细胞催化的生产体系包括：愈创木酚1-20g/L，丙酮酸1-15g/L，醋酸铵3-40g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，工程菌体量1-50g/L；
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【技术特征摘要】
1.一种生产反式3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌包含酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸解氨酶的编码基因。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶的编码基因来源于成团泛菌(pantoea agglomerans)、多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida)或摩氏摩根菌(morganella morganii)；所述酪氨酸解氨酶的编码基因来源于豚鼠耳炎诺卡菌(nocardia otitidiscaviarum)、西宫皮肤球菌(dermacoccus nishinomiyaensis)或cupriavidus pampae。
3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列如seq id no.1-seq id no.3所示；
4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶的氨基酸序列如seqid no.7-seq id no.9所示；
5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的出发菌株包括escherichia coli ...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦勇，杨波，张炜，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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