本发明专利技术属于猪传染性病毒检测领域，公开了一种基于原位环介导等温扩增LAMP的非洲猪瘟病毒ASFV的可抛式电化学传感器的制备方法及其用途。利用电化学工作站收集电流信号，为ASFV的诊断提供了简单、经济、高效的方法。步骤如下：步骤1、构建微型池；步骤2、制备修饰电极；步骤3、基于环介导等温扩增技术构建检测ASFV的电化学生物传感器；步骤4、电化学检测ASFV。本发明专利技术构建的基于LAMP策略的电化学生物传感器，将LAMP与电化学检测相结合来代替传统的荧光传感检测方案，使整个检测系统小型化和简单化。另外，本发明专利技术的电化学检测方法以电流值作为信号输出，性能稳定，实现了ASFV的灵敏检测，同时在丝网印刷电极上电沉积金纳米粒子，进一步提高了检测的灵敏检测。步提高了检测的灵敏检测。步提高了检测的灵敏检测。
【技术实现步骤摘要】
一种基于原位扩增的非洲猪瘟病毒的可抛式电化学传感器的制备方法及其用途
[0001]本专利技术属于猪传染性病毒检测领域，主要涉及一种基于环介导等温扩增(LAMP)的非洲猪瘟病毒(ASFV)的可抛式电化学生物传感检测的方法。
技术介绍
[0002]非洲猪瘟是由ASFV引起的一种急性、高致命性的猪传染病。ASFV不会传染给人类，但对家猪和各种野猪却是非常致命的。该病于1921年首次出现在非洲肯尼亚，自2007年以来，非洲猪瘟已在世界许多国家和地区发生、传播和蔓延。2018年，中国发生了第一例非洲猪瘟，然后病毒迅速蔓延到中国大部分地区。由于至今没有研制出有效的ASFV疫苗和药物治疗，ASFV给国家和畜牧业造成了巨大的经济损失，形势非常严峻。ASFV是一种大型双链DNA病毒，基因组长度约为170
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190kbp，编码约150
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200个蛋白。研究发现E183L基因编码的p54是ASFV的重要结构蛋白，对易感细胞的快速入侵和吸附起着重要作用，因此检测p54具有重要意义。目前最常用的检测p54的方法是酶联免疫吸附法，但该方法操作繁琐，特异性和敏感性低。因此，建立一种快速、灵敏的p54蛋白ASFV检测方法，对实现ASFV的早期检测和分离，减少养猪业的损失具有重要的价值。
[0003]近年来，LAMP作为核酸扩增的有力工具引起了广泛关注。LAMP作为一种替代PCR的方法，克服了传统PCR的缺点，LAMP不需要热循环设备调节温度来进行复杂的温度变化过程，由于使用了4个引物，它们可以识别6/>‑
8个独立的区域，这些区域都是针对特定的靶区，因此具有较高的特异性。此外，在DNA聚合酶的作用下，LAMP速度快，扩增效率高。因此，结合LAMP的优点，可以实现简单、快速、准确的基因检测。
[0004]电化学传感因其操作简单、分析性能优异而被广泛应用于临床实验室。由于这些优势，LAMP技术可以与电化学技术相结合，构建进一步的灵敏检测的生物传感工具。在现有的电化学传感技术和LAMP技术研究的推动下，我们致力于开发一种基于LAMP和电化学技术的便携式可抛式的电化学生物传感器用于检测ASFV。将LAMP引入电化学传感器中，在丝网印刷碳电极(SPCE)表面实现原位扩增，并引入氧化还原探针进行信号输出。此外，在电极上电沉积金纳米粒子(AuNPs)，可以放大电流信号，显著提高传感器的灵敏度。
[0005]因此，本文构建了一种以SPCE电极上电沉积AuNPs为基底的LAMP原位扩增的便携式可抛式电化学生物传感器，该传感器可用于ASFV p54基因组DNA的超灵敏检测，特异性高，准确度高。相关技术还未见相关报道。
技术实现思路
[0006]本专利技术旨在提供一种集快速、简单、低成本等优点为一体的基于LAMP策略电化学生物传感的ASFV灵敏检测，将LAMP与电化学技术相结合，在SPCE上沉积Au NPs，以构建进一步应用的生物传感工具。
[0007]本专利技术将LAMP的信号放大和电化学传感结合使用，构建了一种基于LAMP原位扩增
的便携式可抛式的检测ASFV的电化学生物传感器。本专利技术在电极上修饰带有巯基的引物进行后续的原位LAMP，将dsDNA/Au NPs/SPCE作为电极界面，实现成本低、工艺简单，快速检测ASFV的目的，为ASFV诊断提供了一种简单、经济、高效的方法，同时也提供了一种将LAMP与电化学结合构建新型生物传感检测的新思路。
[0008]一种基于原位扩增的非洲猪瘟病毒的可抛式电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0009]步骤1、电极预处理：
[0010]在5mL含有0.5M H2SO4和0.1M KCl的溶液中对丝网印刷碳电极SPCE进行清洗，进行循环伏安扫描(CV)，扫描范围设定为
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0.2～1.5V，扫描速率为100mV/s，得到稳定的循环伏安曲线后，用二次水淋洗，氮气吹干，备用；
[0011]丝网印刷碳电极SPCE表面设有中心电极区域和外围非电极区域；电极区域包含一个碳工作电极(直径3mm)、一个碳辅助电极和一个Ag/AgCl参比电极；
[0012]步骤2、构建微型池：
[0013]在步骤1预处理过的SPCE的非电极区域覆盖一层聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜(厚度3
‑
5mm)，形成微型池；
[0014]步骤3、制备修饰电极：
[0015]在步骤2中SPCE的电极区域中碳工作电极上电沉积金纳米颗粒Au NPs，制得Au NPs修饰的SPCE工作电极，记为Au NPs/SPCE；
[0016]步骤4、电化学生物传感的构建：
[0017]将引物混合溶液滴在Au NPs/SPCE电极表面，反应一段时间后，用PBS淋洗以除去过量的未结合的引物，最终得到带有引物的电极，记为Primer/Au NPs/SPCE；
[0018]步骤5、ASFV的原位LAMP：
[0019]将核酸扩增反应液和ASFV标准样品混合均匀后滴于步骤4中制备好的Primer/Au NPs/SPCE电极表面，然后将电极置于加热器孵育一段时间后，得到用巯基连接的扩增产物dsDNA/Au NPs/SPCE，构成基于原位扩增的非洲猪瘟病毒的可抛式电化学传感器。
[0020]步骤3中，电沉积Au NPs的具体操作为：
[0021]在新配制的2mM HAuCl4溶液中，采用低电位和高电位分别为
‑
0.2V和1.2V，扫描速率为100mV/s，
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0.2V为起始电位和终止电位，电沉积40圈得Au NPs/SPCE，超纯水淋洗，氮气吹干备用。
[0022]步骤4中，
[0023]采用引物V5在线软件设计ASFV p54基因(Genbank：MN207060.1)的4个引物：巯基修饰的正向内引物SH
‑
FIP，反向内引物BIP，正向外引物F3，反向外引物B3，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
[0024]4条引物序列分别为：
[0025]SH
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FIP：SH
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TGCTGGTCTGTTTGTTGCCGGGGAGCGACTACAGCAAGTG；
[0026]BIP：AGACTAGTCATGGCAACTGGCGCGGATGAGCAGGAGCACT；
[0027]F3：TCCACAACCAGGTACCTCTA；
[0028]B3：AGTGACTGTCGTGTAAGGCT；
[0029]步骤4中，所述引物混合溶液的制备步骤如下：
[0030]将浓度均为100μM的SH
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FIP、BIP、F3、B3溶液按体积比8:8:1:1混合成引物溶液，然后将引物溶液与海藻糖溶液、双蒸汽水按体积比1:1:4的比例混合，形成引物混合溶液；
[0031]引物混合溶液的滴加量为6μL，反应时间2h，反应温度为37℃。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于原位扩增的非洲猪瘟病毒的可抛式电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、电极预处理：在含有H2SO4和KCl的溶液中对丝网印刷碳电极SPCE进行清洗，进行循环伏安扫描，得到稳定的循环伏安曲线后，用二次水淋洗，氮气吹干，备用；丝网印刷碳电极SPCE表面设有中心电极区域和外围非电极区域；电极区域包含一个碳工作电极、一个碳辅助电极和一个Ag/AgCl参比电极；步骤2、构建微型池：在步骤1预处理过的SPCE的非电极区域覆盖一层聚二甲基硅氧烷PDMS膜，形成微型池；步骤3、制备修饰电极：在步骤2中SPCE的电极区域中碳工作电极上电沉积金纳米颗粒Au NPs，制得Au NPs修饰的SPCE工作电极，记为Au NPs/SPCE；步骤4、电化学生物传感的构建：将引物混合溶液滴在Au NPs/SPCE电极表面，反应一段时间后，用PBS淋洗以除去过量的未结合的引物，最终得到带有引物的电极，记为Primer/Au NPs/SPCE；步骤5、ASFV的原位LAMP：将核酸扩增反应液和ASFV标准样品混合均匀后滴于步骤4中制备好的Primer/Au NPs/SPCE电极表面，然后将电极置于加热器孵育一段时间后，得到用巯基连接的扩增产物dsDNA/Au NPs/SPCE，构成基于原位扩增的非洲猪瘟病毒的可抛式电化学传感器。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，含有H2SO4和KCl的溶液中，H2SO4的浓度为0.5M，KCl的浓度为0.1M；含有H2SO4和KCl的溶液用量为5mL；循环伏安扫描的范围设定为
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0.2～1.5V，扫描速率为100mV/s；碳工作电极的直径为3mm；步骤2中，聚二甲基硅氧烷PDMS膜的厚度为3
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5mm。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，电沉积Au NPs的具体操作为：在新配制的2mM HAuCl4溶液中，采用低电位和高电位分别为
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0.2V和1.2V，扫描速率为100mV/s，
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0.2V为起始电位和终止电位，电沉积40圈得Au NPs/SPCE，超纯水淋洗，氮气吹干备用。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，采用引物V5在线软件设计ASFV p54基因的4个引物：巯基修饰的正向内引物SH
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FIP，反向内引物BIP，正向外引物F3和反向外引物B3；4条引物的序列分别为：SH
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【专利技术属性】
技术研发人员：王坤，袁瑞霜，马寒玉，洪红红，肖利亭，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
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