氨基酸生产制造技术

本发明专利技术涉及氨基酸生产。本发明专利技术涉及用于从至少一种C1‑C4烷烃产生至少一种L‑氨基酸的微生物细胞，其中所述细胞包含：(i)能够将所述烷烃转化为相应的1‑烷醇的酶E

Amino acid production

【技术实现步骤摘要】
氨基酸生产
本专利技术涉及生产氨基酸的生物技术方法。具体而言，该方法可以使烷烃作为起始材料用于生产L-氨基酸。
技术介绍
氨基酸作为动物饲料中的添加剂和作为人类的营养补充剂是特别有用的。它们也可以用于输注溶液中，并且可以作为用于制造药物和农业化学品的合成中间体发挥功能。通常在工业上生产化合物诸如甲硫氨酸、赖氨酸、色氨酸和苏氨酸，以用作食品或饲料添加剂以及用于药物中。具体而言，不能由动物合成的必需氨基酸甲硫氨酸在许多身体功能中发挥重要作用。L-甲硫氨酸目前通过化学合成由氰化氢、丙烯醛和甲硫醇生产。这些基于石油的起始材料诸如丙烯醛和甲硫醇通过裂化汽油或石油而获得，这对环境是有害的。此外，由于这些起始材料的成本将与石油价格相关(未来石油价格预期上涨)，因此相对于石油价格的上涨，甲硫氨酸的价格也将上涨。类似地，赖氨酸作为一种必需氨基酸，也不能由动物合成。目前通过发酵方法使用谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌的高性能菌株从糖源诸如糖蜜、蔗糖和/或葡萄糖生产L-赖氨酸。一般而言，农产品的生产和消费将增长，特别是由于发展中国家的需求增加-尤其是对于牛肉和糖。此外，对生物燃料日益增长的需求进一步增加糖的使用和价格。由于氨基酸的市场将受到提供动物饲料的日益增加的成本压力以及日益增加的原料糖价格的影响，所以商业将受到双方的挤压。目前存在四种不同的氨基酸生产方法。它们包括提取、合成、发酵和酶促催化。在这四种方法中，发酵和酶促催化具有最大的经济和生态优势。为了维持有效的含氨基酸的饲料补充剂的竞争力，需要开发使用容易获得且价格合理的原料的氨基酸的生产方法。因此，本领域需要一种更便宜且更有效的生产基于糖的氨基酸的生物技术手段。
技术实现思路
本专利技术试图通过提供从至少一种烷烃产生至少一种氨基酸的生物技术手段来解决上述问题。具体而言，提供了至少一种遗传修饰的微生物细胞，其能够从至少一种烷烃产生至少一种氨基酸。所述氨基酸可以是L-氨基酸，并且可以选自色氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、O-乙酰基高丝氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。在生产至少一种氨基酸的方法中使用这些遗传修饰的细胞可以通过使得能够使用易于获得的替代石油化学原料用于生产氨基酸来为这些化合物的生产增加灵活性。此外，使用能够在其内整合将烷烃转化为氨基酸的完整手段的全细胞生物催化剂，使得转化过程更简单，因为仅仅少量的工艺步骤参与转化。还消除了氨基酸对作为碳底物的简单碳源的依赖性。根据本专利技术的一个方面，提供了用于从至少一种短链烷烃产生至少一种L-氨基酸的微生物细胞，其中所述细胞包含：(i)能够将烷烃转化为相应的1-烷醇的酶E1的相对于野生型细胞增加的表达；(ii)能够将(i)的1-烷醇转化为相应的醛的酶E2的相对于野生型细胞增加的表达；和(iii)(A)-能够将(ii)的醛转化为相应的烷酸的酶E3的相对于野生型细胞增加的表达；和-能够将(iii)的烷酸转化为相应的脂肪酰基硫酯的酶E4的野生型水平表达或酶E4的相对于野生型细胞增加的表达；或者(B)-能够将(ii)的醛转化为相应的脂肪酰基硫酯的酶E5的相对于野生型细胞增加的表达；和(iv)能够将(iii)的脂肪酰基硫酯转化为相应氨基酸的酶E6的相对于野生型细胞增加的表达。烷烃是饱和烃，其具有各种应用，这取决于碳原子的数目和烷烃的结构(即支链、直链、环状等)。烷烃(技术上，总是无环或开链化合物)具有化学通式CnH2n+2。根据本专利技术的任一方面使用的短链烷烃可以是指至少一种具有1-4个碳原子的烷烃。具体而言，具有1至6个碳原子的烷烃包括例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烯、戊烷和己烷。更具体而言，短链烷烃可以选自甲烷、乙烷、丙烷和丁烷。在一个实例中，所述短链烷烃可以是乙烷、丁烷或丙烷。酶E7具体而言，如果根据本专利技术的任一方面使用的烷烃可以是丁烷，则可以将根据本专利技术的任一方面的细胞遗传修饰以相对于野生型细胞增加至少一种酶(E7a)的表达。更具体而言，酶E7a可以选自酰基-ACP合成酶(Eg)(EC6.2.1.20)，酰基-CoA合成酶(Ef)(EC6.2.1.2、EC6.2.1.3、EC6.2.1.10)，以及丁酸激酶(Ehi)(EC2.7.2.7)和磷酸转丁酰酶(Eii)(EC2.3.1.19)的组合。至少一种E7a酶的表达的增加扩增从丁烷产生乙酰基硫酯。具体而言，至少一种E7a酶的表达相对于野生型细胞增加强化反应：丁酸->丁酰基-硫酯->乙酰基-硫酯。具体而言，当根据本专利技术的任一方面用作底物的烷烃是丁烷时，则可以将根据本专利技术的任一方面的细胞遗传修饰以增加至少一种酶E7a的表达。酶E7a可以选自酰基-ACP合成酶(Eg)(EC6.2.1.20)，酰基-CoA合成酶(Ef)(EC6.2.1.2、EC6.2.1.3、EC6.2.1.10)，以及EC2.7.2.1、EC2.7.2.12、EC2.7.2.15或EC2.7.2.7的脂肪酰基激酶(Eh)和EC2.3.1.8或EC2.3.1.19的磷酸转酰基酶(Ei)的组合。具体而言，酶E7a可以是包含SEQIDNO：21或其变体的酰基-ACP合成酶(Eg)，或包含SEQIDNO：22或其变体的酰基-CoA合成酶(Ef)，或包含SEQIDNO：23或其变体的脂肪酰基激酶(Eh)和包含SEQIDNO：24或其变体的磷酸转酰基酶(Ei)的组合。在一个实例中，根据本专利技术的任一方面使用的烷烃可以是丙烷，可以将根据本专利技术的任一方面的细胞遗传修饰以相对于野生型细胞增加至少一种酶(E7b)的表达。更具体而言，酶E7b可以选自酰基-ACP合成酶(Eg)(EC6.2.1.20)，酰基-CoA合成酶(Ef)(EC6.2.1.2、EC6.2.1.3、EC6.2.1.10)，甲基异柠檬酸水解酶(hydro-lyase)(E7bi)(EC4.2.1.99)，甲基异柠檬酸裂解酶(E7bii)(EC4.1.3.30)，2-甲基异柠檬酸脱水酶(E7biii)(EC4.2.1.79)，2-甲基柠檬酸合酶(E7biv)(EC2.3.3.5)，磷酸转丙酰酶(phosphotranspropionylase)(Eiii)(EC2.3.1.19、EC2.3.1.8)、丙酸激酶(Ehii)(EC2.7.2.15)和丙酰-CoA连接酶(E7bvii)(EC6.2.1.17)和丙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶(E7bviii)(EC2.8.3.1)的组合。至少一种E7b酶的表达的增加扩增从丙烷产生乙酰基硫酯。具体而言，至少一种E7b酶的表达相对于野生型细胞增加强化反应：丙酸->丙酰基-硫酯->乙酰基-硫酯。具体而言，当根据本专利技术的任一方面用作底物的烷烃是丙烷时，则可以将根据本专利技术的任一方面的细胞遗传修饰以增加至少一种酶E7b的表达。酶E7b可以选自酰基-ACP合成酶(Eg)(EC6.2.1.20)，酰基-CoA合成酶(Ef)(EC6.2.1.2、EC6.2.1.3、EC6.2.1.10)，甲基异柠檬酸水解酶(E7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于从至少一种C1-C4烷烃产生至少一种L-氨基酸的微生物细胞，其中所述细胞包含：/n(i)能够将所述烷烃转化为相应的1-烷醇的酶E

【技术特征摘要】
20180822 EP 18190216.41.用于从至少一种C1-C4烷烃产生至少一种L-氨基酸的微生物细胞，其中所述细胞包含：
(i)能够将所述烷烃转化为相应的1-烷醇的酶E1的相对于野生型细胞增加的表达；
(ii)能够将(i)的1-烷醇转化为相应的醛的酶E2的相对于野生型细胞增加的表达；和
(iii)(A)
-能够将(ii)的醛转化为相应的烷酸的酶E3的相对于野生型细胞增加的表达；和
-能够将(iii)的烷酸转化为相应的脂肪酰基硫酯的酶E4的野生型水平表达或酶E4的相对于野生型细胞增加的表达；或者
(B)
-能够将(ii)的醛转化为相应的脂肪酰基硫酯的酶E5的相对于野生型细胞增加的表达；
和
(iv)能够将(iii)的脂肪酰基硫酯转化为相应氨基酸的酶E6的相对于野生型细胞增加的表达。


2.根据权利要求1所述的细胞，其中产生的氨基酸选自赖氨酸、苏氨酸和O-乙酰基高丝氨酸。


3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中产生的氨基酸是赖氨酸，且
-酶E1选自EC1.14.15.3-的P450烷烃羟化酶(Ea)、来自AlkBGT组件的EC1.14.15.3的AlkB烷烃羟化酶(Eb)、EC1.14.18.3、1.14.99.39或1.14.13.25的甲烷单加氧酶(Ek)、EC.1.14.13.227的丙烷单加氧酶(El)和EC1.14.13.230的丁烷单加氧酶(Em)；
-酶E2选自EC1.14.15.3-的P450烷烃羟化酶(Ea)、来自AlkBGT组件的EC1.14.15.3的AlkB烷烃羟化酶(Eb)、EC1.1.3.20的醇氧化酶(Ec)和EC1.1.1.1或EC1.1.1.2的醇脱氢酶(Ed)；
-酶E3选自EC1.14.15.3-的P450烷烃羟化酶(Ea)、来自AlkBGT组件的EC1.14.15.3的AlkB烷烃羟化酶(Eb)、EC1.2.1.3、EC1.2.1.4或EC1.2.1.5的醛脱氢酶(Ee)、EC1.1.3.20的双功能醇氧化酶(Ec)、EC1.1.99的双功能AlkJ醇脱氢酶(Edi)和EC1.1.1.1或EC1.1.1.2的双功能醇脱氢酶(Edii)，其中Ec、Edi和Edii能够将ω-羟基烷酸酯直接氧化成相应的ω-羧基烷酸酯；
-酶E4选自EC6.2.1.1、EC6.2.1.2或EC6.2.1.3的脂肪酰基辅酶A(CoA)合酶(Ef)；EC6.2.1.20或EC6.2.1.47的酰基-酰基载体蛋白(ACP)合酶(Eg)；EC2.7.2.1、EC2.7.2.12、EC2.7.2.15或EC2.7.2.7的脂肪酰基激酶(Eh)和EC2.3.1.8或EC2.3.1.19的磷酸转酰基酶(Ei)的组合；和EC6.2.1.1、EC6.2.1.2或EC6.2.1.3的脂肪酰基-CoA合酶(Ef)和EC2.3.1.38或EC2.3.1.39的脂肪酰基-CoA：ACP转酰基酶(Ej)的组合；
-酶E5是EC1.2.1.10或EC1.2.1.87的CoA-连接的醛脱氢酶(Eei)；且
-酶E6选自天冬氨酸激酶(E6a)(EC2.7.2.4)、天冬氨酸半醛脱氢酶(E6b)(EC1.2.1.11)、4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(E6c)(EC1.4.1.16)、二氢吡啶二羧酸还原酶(E6d)(EC1.17.1.8)、二氨基庚二酸脱羧酶(E6e)(EC4.1.1.20)、赖氨酸输出蛋白(E6f)(TCDB家族2.A.124.1.1、2.A.75.1.1或2.A.75.1.2)、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶(E6g)(EC4.1.1.31)、质子转位转氢酶(E6h)(EC1.6.1.5)和丙酮酸羧化酶(E6i)(EC6.4.1.1)。


4.根据权利要求3所述的细胞，其中所述酶E6选自天冬氨酸激酶(E6a)和4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(E6c)(EC1.4.1.16)。


5.根据权利要求3或4所述的细胞，其中所述酶E6是包含SEQIDNO：1的天冬氨酸激酶(E6a)的反馈抗性变体，或包含SEQIDNO：3的4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(E6c)(EC1.4.1.16)的反馈抗性变体。


6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中产生的氨基酸是赖氨酸，且酶
-E1是丁烷单加氧酶(Ec)(EC1.14.13.230)，优选包含具有登录号AAM19732.1、AAM19730.1、AAM19728.1、AAM19727.1、AAM19729.1和ABU68845.2的序列或其变体；
-E2是醇脱氢酶(Ed)(EC1.1.1.1或EC1.1.1.2)，优选包含SEQIDNO：91或其变体；
-E3是醛脱氢酶(Ee)(EC1.2.1.3、EC1.2.1.4或EC1.2.1.5)，优选包含SEQIDNO：42或其变体；
-E4是脂肪酰基CoA合酶(FACS)(Ef)(EC6.2.1.1、EC6.2.1.2或EC6.2.1.3)，优选包含SEQIDNO：88或其变体；且
-E6是至少一种选自以下的酶：
(i)天冬氨酸激酶(E6a)的反馈抗性变体，优选包含具有T342I的点突变的SEQIDNO：1，或具有至少一个选自以下的点突变的SEQIDNO：79：T311I、A279T、S301Y、A279V、S301F、T308I、S317A、R320G、G345D、S381F、Q404E、G408R、G277A、Q298A、T361A、E363A和F364A，以及
(ii)4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(E6c)(EC1.4.1.16)的反馈抗性变体，优选包含SEQIDNO：3或其包含点突变G84T、G250A和/或A251C的变体。


7.根据权利要求1或2所述的细胞，其中产生的氨基酸是O-乙酰基高丝氨酸，且
-酶E1选自EC1.14.15.3-的P450烷烃羟化酶(Ea)、来自AlkBGT组件的EC1.14.15.3的AlkB烷烃羟化酶(Eb)、EC1.14.18.3、1.14.99.39或1.14.13.25的甲烷单加氧酶(Ek)、EC.1.14.13.227的丙烷单加氧酶(El)和EC1.14.13.230的丁烷单加氧酶(Em)；
-酶E2选自EC1.14.15.3-的P450烷烃羟化酶(Ea)、来自AlkBGT组件的EC1.14.15.3的AlkB烷烃羟化酶(Eb)、EC1.1.3.20的醇氧化酶(Ec)和EC1.1.1.1或EC1.1.1.2的醇脱氢酶(Ed)；
-酶E3选自EC1....

【专利技术属性】
技术研发人员：P·恩格尔，S·沙菲尔，O·图姆，H·安德烈，C·格林，B·格伦德，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE