一种提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达DNA疫苗及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种提高动物繁殖力的AMH‑GNIH双表达基因疫苗及其工程菌的制作方法。该工程菌于2018年8月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2018542。将该工程菌直接免疫动物或与DNA疫苗佐剂混合后免疫动物，可有效提高动物的繁殖力。其双表达基因为抗穆勒氏管激素和促性腺激素释放抑制激素的双表达非抗性DNA质粒，可以直接免疫动物，通过喷鼻、口服、拌饲等方式，经黏膜免疫产生抗体。由于不含抗性基因，不须引入外源抗生素进行筛选，所以不产生抗生素残留。相对于其它基因疫苗需要质粒提取、纯化，生产成本较高，肌肉注射麻烦，并使动物产生应激反应，该疫苗生产成本低，使用方便，而且无抗性和注射应激反应。

An amh-gnih double expression DNA vaccine for improving animal fecundity and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一种提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达DNA疫苗及其构建方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗及其制备方法与应用。
技术介绍
卵泡发育是一个周期性的过程，受多种激素的综合调控，即有促进卵泡发育的激素，如促性腺激素、促性腺激素释放激素，也有抑制卵泡发育的激素，如抗穆勒氏管激素(Anti-Müllerianhormone，AMH)、卵泡抑制素(inhibin，INH)和促性腺激素释放抑制激素(Gonadotropininhibitinghormone,GnIH)等。AMH是参与调节生长和分化的糖蛋白转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员，对卵泡发育有抑制作用。敲除AMH能够解除其对原始卵泡的募集作用，使有腔卵泡数量增加。AMH能削弱生长因子Kit配体(KL)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和角化细胞生长因子(KGF)对原始卵泡发育的刺激作用，提示AMH能减少原始卵泡向初级卵泡的转变，抑制原始卵泡的基础性和刺激性发育。对山羊卵巢进行免疫组化分析，发现AMH定位于卵母细胞和颗粒细胞(原始卵泡到有腔卵泡阶段)。与阴性对照相比，阳性对照(在培养基中培养或加入Kit配体)的原始卵泡百分率降低，生长卵泡的百分率升高，原始卵泡被激活。但是，在培养基中添加AMH表现出与阴性对照相似的原始卵泡和生长卵泡百分比。这些结果表明，AMH阻碍原始卵泡的启动。GnIH是日本学者于2000年最先从鹌鹑脑内成功分离、纯化得到的RF(精氨酸-苯丙氨酸)酰胺肽(RFRP)，生物学作用与GnRH相反，主要抑制垂体前叶分泌FSH(促卵泡素)和LH(促黄体素)。随后，从哺乳动物脑中鉴定的GnIH直系同源物命名为RFamide(RFRP)相关肽，包含：RFRP-1，RFRP-2，RFRP-3。其中，RFRP-3是生殖的主要调节因子，类似于体内抑制素的生理功能。GnIH及其类似物不仅能通过GPR147作用于下丘脑的垂体和GnRH神经元，而且还能抑制促性腺激素的合成和释放以及性腺的发育和维持。在哺乳动物生殖的不同发育阶段，包括初情期前、初情期、发情周期、妊娠、泌乳、绝经和卵巢疾病中，RFRPs已被证实是卵巢发育的关键介质、GnRH释放的潜在抑制调节因子，可能通过GnRH的上游调节因子间接发挥其对卵泡发育的影响，或直接通过GnRH神经元的子集发挥作用。除了调节促性腺激素分泌外，GnIH通过改变脑中神经类固醇生物合成进一步调节生殖行为。GnIH能抑制鸡和鹌鹑脑垂体释放LH和FSH。静脉给予RFRP-3可降低性腺切除雄性大鼠外周血促性腺激素水平，抑制成年小鼠睾丸类固醇激素生成和精子发生，绵羊LH脉冲幅度，抑制LH和FSH分泌。此外，也有研究表明，GnIH抑制鸡的卵泡发育和类固醇生成。以上研究提示，GnIH可能直接或间接抑制卵泡发育和排卵。
技术实现思路
本专利技术的目的，是提供一种具有提高动物繁殖力作用的AMH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌。本专利技术的另一个目的是提供一种非抗性筛选的抗穆勒氏管激素和促性腺激素释放抑制激素的共表达质粒；该质粒可作为DNA疫苗免疫动物，提高动物的繁殖能力，克服了一些技术难题。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种具有提高动物繁殖力作用的AMH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌，该工程菌于2018年8月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，保藏编号：CCTCCM2018542，分类命名为猪霍乱沙门式菌C500/PVAX-SAMH-2A-SRFRP-asd(SalmonellaentericaC500/PVAX-SAMH-2A-SRFRP-asd)。由上述工程菌株制备的AMH-GNIH双表达基因疫苗工程菌，通过SDS碱裂解法抽提即可得到AMH-GNIH双表达基因质粒(PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd质粒)。一种提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗，其特征在于，其依次包括tPA-SAMH基因和tPA-SRFRP基因。如上所述的AMH-GNIH双表达基因疫苗，所述tPA-SRFRP的基因序列如SEQIDNO.2所示，所述tPA-SAMH的基因序列如SEQIDNO.1所示。如上所述的AMH-GNIH双表达基因疫苗，所述tPA-SAMH基因和tPA-SRFRP基因之间连接有2A肽，所述2A肽的基因序列如SEQIDNO.3所示。一种如上所述提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗的制备方法，其包括如下步骤：S1、将质粒PVAX-tPA-SAMH-asd和PVAX-tPA-SRFRP-asd进行PCR扩增，获得tPA-SAMH、tPA-SRFRP扩增产物片段；所述tPA-SAMH扩增产物片段含如SEQIDNO.1所示的序列，所述tPA-SRFRP扩增产物片段含如SEQIDNO.2所示的序列；S2、将pVAX-asd和tPA-SRFRPPCR扩增产物进行EcoRI和XhoI酶切，连接，获得质粒PVAX-tPA-SRFRP-asd；S3、将PVAX-tPA-SRFRP-asd和tPA-SAMHPCR产物进行HindIII和KpnI酶切，连接，获得质粒PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd；S4、2A肽拼接头经上海生工合成并克隆于PUC57载体上；其中，所述2A肽含如SEQIDNO.3所示的序列；S5、将PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd和PUC57-2A'-2A质粒进行KpnI和BamHI酶切，连接，获得质粒PVAX-tPA-SINH-2A-tPA-SRFRP-asd。S6、将PVAX-tPA-SRFRP-asd进行PCR扩增，引入酶切位点BamHI和XhoI(置换酶切位点)，获得tPA-SRFRP扩增产物片段；将S4获得的PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd和tPA-SRFRP扩增产物片段进行BamHI和XhoI酶切，连接，获得质粒PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd。如上所述的提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗或上述所述的制备方法制备的疫苗在制备提高动物繁殖力药品中的应用。将含有提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌，(PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd)直接免疫动物或与DNA疫苗佐剂混合后免疫动物，能够提高动物繁殖力。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的一种非抗性筛选的抗穆勒氏管激素和促性腺激素释放抑制激素的共表达质粒，具有如下优点：1、抗穆勒氏管激素和促性腺激素释放抑制激素的双表达非抗性DNA质粒PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd，能够表达免疫原性较强的抗穆勒氏管激素(AMH)和促性腺激素释放抑制激素(RFRP)两种蛋白，刺激小鼠产生较高的抗体水平。2、含有提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌C5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌，其特征在于，该工程菌于2018年8月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2018542。/n

【技术特征摘要】
1.一种含有提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌，其特征在于，该工程菌于2018年8月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCM2018542。


2.由权利要求1所述工程菌株制备的AMH-GNIH双表达基因疫苗。


3.一种提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗，其特征在于，其包括tPA-SAMH基因和tPA-SRFRP基因，所述tPA-SAMH的基因序列如SEQIDNO.1所示，所述tPA-SRFRP的基因序列如SEQIDNO.2所示。


4.根据权利要求3所述的双表达基因疫苗，其特征在于，所述tPA-SAMH基因和tPA-SRFRP基因之间连接有2A肽，所述2A肽的基因序列如SEQIDNO.3所示，所述AMH-GNIH双表达基因疫苗的基因序列是SEQIDNO.1、SEQIDNO.3和SEQIDNO.2所示序列依次连接。


5.一种提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗的制备方法，其特征在于如下操作步骤：
S1、将质粒PVAX-tPA-SAMH-asd和PVAX-tPA-SRFRP-asd进行PCR扩增，获得tPA-SAMH、tPA-SRFRP扩增产物片段；所述tPA-SAMH扩增产物片段含如SEQIDNO.1所示的序列，所述tPA-SRFRP扩增产物片段含如SEQIDNO.2所示的序列；
S2、将pVAX-asd和tPA-SRFRPPCR扩增产物进行EcoRI和XhoI酶切，连接，获得质粒PVAX-tPA-SRFRP-asd；
S3、将PVAX-tPA-SRFRP-asd和tPA-SAMHPCR产物进行HindIII和...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨利国，唐姣美，周群莉，滑国华，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42