一种高产白原胶的工程菌株及其构建与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种高产白原胶的工程菌株及其构建与应用，所述菌株为野油菜黄单胞菌菌株经基因工程方法敲除群体感应退出关键基因rpfB和菌黄素关键合成基因xanK构建得到；所述野油菜黄单胞菌菌株为黄原胶工业生产菌，保藏编号为CGMCC1.1781。本发明专利技术通过敲除其菌群体感应退出系统和菌黄素生物合成合成途径,构建了高产白原胶(没有菌黄素污染的黄原胶)的工程菌株，产品品质大大提高；白原胶中没有菌黄素污染，生产上也无需进一步进行“脱黄”的工序，从而降低了生产成本，具有非常好的应用前景。

Construction and application of an engineering strain with high yield of xanthan gum

【技术实现步骤摘要】
一种高产白原胶的工程菌株及其构建与应用
本专利技术涉及一种高产白原胶的工程菌株及其构建与应用。
技术介绍
黄原胶是由植物病原菌野油菜黄单胞菌产生的一种天然胞外多糖，结构为由重复的碳水化合物单元聚合而成。黄原胶属于水溶性胶体，为非牛顿型流体，具有优良的流变学特性，作为稳定剂和增稠剂等被广泛应用于包括食品、药品、化妆品和石油开采等多个行业。中国为工业发酵生产黄原胶第一大国，年产量约占全球产量的70％，而人民对黄原胶的需求随着经济发展快速提高，因此提高工业发酵生产黄原胶的能力势在必行。目前的专利技术主要通过优化发酵条件来提高发酵生产黄原胶能力，降低发酵成本，对提高黄原胶产量帮助不大。而且由于黄单胞菌还产生黄色菌黄素，是黄原胶生产过程的杂质。生产上为了除去这些菌黄素，专门有一道工序是“脱黄”。现有技术中，专利CN109385391A中公开了一种用于发酵生产耐高温黄原胶的工程菌株，其通过敲除野油菜黄单胞菌中的丙酮酰基转移酶基因gumL，构建的工程菌株在合成的黄原胶时不需要任何发酵后处理就可以耐高温。但该工程菌株黄原胶产量不高，含有菌黄素，需要脱黄处理，生产成本高。专利CN110016480A公开了一种菌黄素合成相关基因XC_4092，通过将野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的野生菌株Xcc8004基因组中的该基因失活获得生产无色黄原胶的工程菌。但该工程菌是基于一个低产黄原胶菌株，黄原黄胶发酵效价低，生产成本高。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术目的在于提出了一种高产白原胶的工程菌株及其构建与应用。本专利技术基于黄原胶生物合成及其群体感应调控机制，通过破坏天然的群体感应退出机制，大大提高了黄原胶的产量，对黄原胶的品质没有影响；敲除菌黄素生物合成关键基因，构建了双突变菌株ΔrpfBΔxanK突变株，又进一步提高黄原胶产量，且其不产生菌黄素，没有黄色杂质产生，所得到的“白原胶”品质比黄原胶高，生产成本降低。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术提供一种高产白原胶的工程菌株，所述菌株为野油菜黄单胞菌菌株经基因工程方法敲除rpfB基因和xanK基因构建得到。优选地，所述野油菜黄单胞菌菌株的保藏编号为CGMCC1.1781，但并不限于此。第二方面，本专利技术提供一种高产白原胶的工程菌株的构建方法，包括如下步骤：A、构建敲除rpfB基因的重组质粒和敲除xanK基因的重组质粒；B、将步骤A构建的重组质粒转入野油菜黄单胞菌菌株中，培养后筛选得到敲除rpfB基因的突变株ΔrpfB菌株或敲除xanK基因的突变株ΔxanK菌株；C、将步骤A构建的敲除xanK基因的重组质粒转入突变株ΔrpfB菌株中，或将敲除rpfB基因的重组质粒转入突变株ΔxanK菌株中，筛选得到敲除rpfB和xanK基因的双突变株ΔrpfBΔxanK菌株，即所述的高产白原胶的工程菌株。优选地，所述步骤A中构建敲除rpfB基因的重组质粒的具体方法如下：A1、以野油菜黄单胞菌菌株基因组DNA为模板，通过PCR获得rpfB基因的上下游DNA片段；A2、以rpfB基因的上下游DNA片段为模板，通过FUSIONPCR获得融合产物；A3、将融合产物与载体酶连后转入感受态细胞，即得所述重组质粒。优选地，所述步骤A1中，采用的PCR引物序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:4所示；步骤A2中，采用的PCR引物序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:4所示。优选地，所述步骤B的培养后筛选的步骤具体如下：将菌株在含有利福霉素和卡那霉素的LB平板培养基上培养，筛选得到整合子；将整合子稀释后涂布在含利福霉素和5％蔗糖的LB平板培养基上培养，通过菌落PCR挑选得到ΔrpfB菌株。优选地，所述步骤A中构建敲除xanK基因的重组质粒的具体方法如下：A1’、以野油菜黄单胞菌菌株基因组DNA为模板，通过PCR获得xanK基因的上下游DNA片段；A2’、以xanK基因的上下游DNA片段为模板，通过FUSIONPCR获得融合产物；A3’、将融合产物与载体酶连后转入感受态细胞，即得所述重组质粒。优选地，步骤A1’中，采用的PCR引物序列如SEQIDNO:7～SEQIDNO:10所示；步骤A2’中，采用的PCR引物序列如SEQIDNO:7和SEQIDNO:10所示。优选地，所述步骤C的培养后筛选的步骤具体如下：将菌株在含有利福霉素和卡那霉素的LB平板培养基上培养，筛选得到整合子；将整合子稀释后涂布在含利福霉素和5％蔗糖的LB平板培养基上培养，通过菌落PCR挑选得到ΔrpfBΔxanK菌株。第三方面，本专利技术提供一种根据前述的工程菌株生产白原胶的方法，包括以下步骤：将所述工程菌株接种到NYG液体培养基中培养，然后离心、沉淀，即得。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：(1)本专利技术提供了一株敲除rpfB和xanK的突变株，该突变株能稳定复制和遗传。(2)本专利技术构建的ΔrpfBΔxanK突变株不产生菌黄素,产生的胞外多糖(黄原胶)不含色素，重新命名为“白原胶”，白原胶产量比原始菌株黄单胞菌黄原胶产量高147％。(3)本专利技术提供了有效构建野油菜黄单胞菌XC1中同时敲除rpfB和xanK突变株的方法，该构建方法能显著提高黄原胶产量和品质。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为利用所得菌株基因组DNA，通过PCR分析的结果；其中图1A为利用rpfBFOR-1和rpfBREV-2引物验证野生型菌株和rpfB突变体；图1B为利用rpfB-F(Y)和rpfB-R(Y)引物验证野生型菌株和rpfB突变体；图2为DNA测序序列分析rpfB突变体的结果；图3为利用所得菌株基因组DNA，通过PCR分析的结果；其中图3A为利用xanKFOR-1和xanKREV-2引物验证野生型菌株和xanK突变体；图3B为利用xanK-F(Y)和xanK-R(Y)引物验证野生型菌株和xanK突变体；图4为DNA测序序列分析xanK突变体的结果；图5为在NAS培养中培养48小时后，三个菌株XC1、ΔrpfB和ΔrpfBΔxanK的白原胶产量定性分析结果；图6为三个菌株XC1、ΔrpfB和ΔrpfBΔxanK在NAS液体培养基中的生长和白原胶产量定量分析；其中图6A为生长曲线；图6B为接种培养24h,36h和48h后，白原胶产量；图7为野生型菌株XC1与双突变体ΔrpfBΔxanK在5L发酵体系中发酵液颜色对比和白原胶提取情况；图8为四个菌株XC1、ΔrpfB、ΔxanK和ΔrpfBΔxanK菌落颜色和菌黄素定量检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产白原胶的工程菌株，其特征在于，所述菌株为野油菜黄单胞菌菌株经基因工程方法敲除rpfB基因和xanK基因构建得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种高产白原胶的工程菌株，其特征在于，所述菌株为野油菜黄单胞菌菌株经基因工程方法敲除rpfB基因和xanK基因构建得到。


2.根据权利要求1所述的高产白原胶的工程菌株，其特征在于，所述野油菜黄单胞菌菌株的保藏编号为CGMCC1.1781。


3.一种根据权利要求1所述的高产白原胶的工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、构建敲除rpfB基因的重组质粒和敲除xanK基因的重组质粒；
B、将步骤A构建的重组质粒转入野油菜黄单胞菌菌株中，培养后筛选得到敲除rpfB基因的突变株ΔrpfB菌株或敲除xanK基因的突变株ΔxanK菌株；
C、将步骤A构建的敲除xanK基因的重组质粒转入突变株ΔrpfB菌株中，或将敲除rpfB基因的重组质粒转入突变株ΔxanK菌株中，筛选得到敲除rpfB和xanK基因的双突变株ΔrpfBΔxanK菌株，即所述的高产白原胶的工程菌株。


4.根据权利要求3所述的高产白原胶的工程菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤A中构建敲除rpfB基因的重组质粒的具体方法如下：
A1、以野油菜黄单胞菌菌株基因组DNA为模板，通过PCR获得rpfB基因的上下游DNA片段；
A2、以rpfB基因的上下游DNA片段为模板，通过FUSIONPCR获得融合产物；
A3、将融合产物与载体酶连后转入感受态细胞，即得所述重组质粒。


5.根据权利要求4所述的高产白原胶的工程菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤A1中，采用的PCR引物序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:4所示；
步骤A2中，采用的PCR引物序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：何亚文，邱嘉辉，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31