敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1‑脱氧野尻霉素产量中的应用，本发明专利技术通过基因工程的方法敲除了解淀粉芽胞杆菌LX‑12的基因组内的

Application of knockout of nanr gene of Bacillus amylolyticus in increasing the yield of 1-deoxynojirimycin

【技术实现步骤摘要】
敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用，通过敲除解淀粉芽胞杆菌转录调控因子nanR，提高了解淀粉芽胞杆菌1-脱氧野尻霉素产量，这为解淀粉芽胞杆菌高产1-脱氧野尻霉素提供了一种策略。
技术介绍
糖尿病已经成为继心脑血管疾病和肿瘤之后威胁人类的第三号杀手，对全球的健康和经济带来了重大的威胁。1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)简称DNJ或1-DNJ，是一种多羟基哌啶类生物碱，具有强效的α-葡萄糖苷酶抑制活性。1-脱氧野尻霉素及其衍生物作为高效的糖苷酶抑制剂，在药物开发中受到广泛重视。近年来利用微生物合成1-脱氧野尻霉素已成为研究热点，但目前微生物合成1-脱氧野尻霉素的产量低，还不能满足市场的需求。NanR是一种转录调控因子，其在解淀粉芽胞杆菌中的调控网络和调控具体的基因还没有相关报道。本专利通过敲除解淀粉芽胞杆菌LX-12中转录调控因子NanR，提高了解淀粉芽胞杆菌1-脱氧野尻霉素的产量。本专利技术首次通过敲除转录因子基因nanR来提高1-脱氧野尻霉素产量，为1-脱氧野尻霉素高产提供一种新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用。本专利技术的另一个目的在于提供了敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因的方法。本专利技术的最后一个目的在于提供了敲除了nanR基因的解淀粉芽胞杆菌在高产1-脱氧野尻霉素产量中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用，包括利用本专利技术的常规技术，将解淀粉芽胞杆菌中的nanR基因敲除，敲除后的菌株可用于1-脱氧野尻霉素的发酵生产；以上所述的应用中，优选的，所述的解淀粉芽胞杆菌为生产1-脱氧野尻霉素的菌株；以上所述的应用中，优选的，所述的解淀粉芽胞杆菌的保藏编号为CCTCCNO：M2015234。以上所述的应用中，解淀粉芽胞杆菌基因nanR的敲除方法，包括以下步骤：(1)以解淀粉芽胞杆菌LX-12(CCTCCNO：M2015234)的基因组DNA为模板，PCR扩增出nanR基因的上游同源臂和nanR基因的下游同源臂；(2)通过重叠延伸PCR将nanR基因的上游同源臂和nanR基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；(4)准备质粒T2(2)-ori，并采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；(5)将步骤(3)得到的酶切基因片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔnanR；(6)将敲除质粒T2(2)-ΔnanR转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；(7)将阳性转化子转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到nanR基因的上游同源臂或nanR基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；(8)挑选nanR基因的上游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与nanR基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了nanR基因的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LX-12ΔnanR；以上所述的应用中，优选的，在应用过程中以敲除了解淀粉芽胞杆菌nanR基因的菌株发酵生产1-脱氧野尻霉素时，其发酵培养基配方为：60-100g/L豆粕；50-80g/L玉米淀粉；0.5-1.0g/LKH2PO4；0.3-0.6g/LMgSO4·7H2O；0.1-0.3g/LFeSO4·7H2O；0.01-0.05g/LMnSO4·H2O，其余为水。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：与解淀粉芽胞杆菌LX-12相比，通过本专利技术构建得到的解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔnanR的1-脱氧野尻霉素产量提高了15％以上。本专利技术的研究结果表明：敲除解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA中的nanR为提高1-脱氧野尻霉素产量提供了一种新的方法。附图说明图1为实施例1步骤(1)得到的nanR基因上游同源臂和nanR基因下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为nanR基因的上游同源臂，泳道2为nanR基因的下游同源臂。图2为实施例1步骤(2)得到的目的基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为步骤(2)得到的目的基因片段。图3为实施例1步骤(5)得到的敲除质粒T2(2)-ΔnanR进行菌落PCR验证图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为敲除质粒T2(2)-ΔnanR进行菌落PCR验证的条带。图4为实施例1步骤(8)得到的敲除了nanR基因的解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔnanR的验证条带。其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔnanR的验证条带，泳道2为解淀粉芽胞杆菌LX-12的对照条带。其中，上述DNAmarker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。本专利技术所述技术方案，如未特别说明，为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：nanR基因缺失的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LX-12ΔnanR的获得：所述的nanR基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。(1)以解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA为模板，PCR扩增出nanR基因的上游同源臂(引物为nanR-F1、nanR-R1)和nanR基因的下游同源臂(引物为nanR-F2、nanR-R2)；nanR-F1：GGGAGCTCGGATGACCCGATACTTGAA、nanR-R1：TGTGGATCCGGATAGCAGGCCGAGAACACTGGATGA、nanR-F2：TCATCCAGTGTTCTCGGCCTGCTATCCGGATCCACA、nanR-R2：GCTCTAGAGCCGCACAGATTCATAGA；(2)以nanR基因的上游同源臂和nanR基因的下游同源臂片段为模板，上游同源臂引物nanR-F1、下游同源臂引物na本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，所述的解淀粉芽胞杆菌为生产1-脱氧野尻霉素的菌株。


3.根据权利要求1所述的应用，所述的解淀粉芽胞杆菌的保藏编号为CCTCCNO：M2015234。


4.根据权利要求3所述的应用，所述的敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因，其方法包括：
（1）以保藏编号为CCTCCNO：M2015234的解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA为模板，PCR扩增出nanR基因的上游同源臂和nanR基因的下游同源臂；
（2）通过重叠延伸PCR将nanR基因的上游同源臂和nanR基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；
（3）采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
（4）准备质粒T2(2)-ori，并采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
（5）将步骤（3）得到的酶切基因片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔnanR；
（6）将敲除质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，芦玉，蔡冬波，冀志霞，马昕，陈建刚，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42