一种调控细胞形态改善聚乳酸生产性能的策略制造技术

本发明专利技术公开了一种调控细胞形态改善聚乳酸生产性能的策略，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过分子生物学手段，利用细胞分裂抑制剂，抑制细胞分裂，达到提高细胞的体积和比表面积，便于胞内产品的积累。通过引入靶向细胞分裂抑制剂的调控线路，扩大了细胞的体积，使得聚乳酸胞内积累变多。通过本发明专利技术生产的聚乳酸含量达到53.8w％，干重达到27.2g/L。

A strategy to control cell morphology and improve PLA production performance

【技术实现步骤摘要】
一种调控细胞形态改善聚乳酸生产性能的策略
本专利技术涉及一种调控细胞形态改善聚乳酸生产性能的策略，属于生物工程

技术介绍
聚乳酸是一种良好的生物兼容性材料，聚乳酸是以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物，原料来源充分而且可以再生。聚乳酸的生产过程无污染，而且产品可以生物降解，实现在自然界中的循环，因此是理想的绿色高分子材料。动态调控系统是代谢工程领域中新兴的代谢流调控手段，其区别于静态调控的主要特征是在发酵过程中，工程菌株会根据发酵时间、生理状态、胞内代谢物浓度、胞外环境变化做出相应的酶活调整，进而影响代谢流分布，提高产品生产能力。目前生产聚乳酸的方法主要有控制路径酶比例、调节辅因子平衡、模型预测敲除靶点，含量最高能到49％，但是存在含量低、下游分离困难、耗时长、污染大的问题。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种基因工程菌，表达调控细胞大小的靶点基因和调控聚乳酸生产的靶点基因；所述调控细胞大小的靶点基因包括编码细胞分裂抑制剂SuaA的基因sulA，所述细胞分裂抑制剂SuaA的氨基酸序列与SEQIDNO.1编码的氨基酸序列一致；所述调控聚乳酸生产的靶点基因包括编码酮酯宪硫解酶phaA的基因phaA，编码乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB的基因phaB，编码聚羟基丁酸合酶phaC的基因phaC和编码丙酰辅酶A转移酶pCT的基因pct；所述酮酯宪硫解酶phaA的氨基酸序列与SEQIDNO.2编码的氨基酸序列一致，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的氨基酸序列与SEQIDNO.3编码的氨基酸序列一致，所述聚羟基丁酸合酶的氨基酸序列与SEQIDNO.4编码的氨基酸序列一致，所述丙酰辅酶A转移酶pCT的氨基酸序列与SEQIDNO.5编码的氨基酸序列一致。在本专利技术的一种实施方式中，编码细胞分裂抑制剂SuaA的基因sulA的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码酮酯宪硫解酶phaA的基因phaA的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB的基因phaB的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码聚羟基丁酸合酶phaC的基因phaC的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码丙酰辅酶A转移酶pCT的基因pct的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，以PJ23119-phaABC-pCT和pSC101-sulA为表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，以乳酸生产菌株GL0002为宿主。所述乳酸生产菌株GL0002的构建方法公开于文献：GuoL,ZhangF,ZhangC,HuG,GaoC,ChenX,etal.EnhancementofmalateproductionthroughengineeringoftheperiplasmicrTCApathwayinEscherichiacoli.BiotechnolBioeng2018,115(6):1571-1580.。所述PJ23119-phaABC-pCT表达了酮酯宪硫解酶phaA、乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB、聚羟基丁酸合酶phaC和丙酰辅酶A转移酶pct。所述的PJ23119-phaABC-pCT质粒的构建方法为：(1)以商业化质粒pTargetF(AddgenePlasmid#62226)为基础，采用全质粒PCR的方式，在rrnBT1终止子后插入T7Te终止子序列，以减少泄露表达；进一步地，采用全质粒PCR的方式，去除sgRNA表达框，获得仅含有Pj23119组成型启动子和双终止的工程质粒pJ01；(2)以罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)基因组为模板，设计含有B0034RBS(核苷酸序列如SEQIDNO.6所示)的引物，分别扩增获得phaA、phaB基因，将phaA、phaB两个基因采用多基因一步同源重组的方式，插入至Pj23119(核苷酸序列如SEQIDNO.7所示)的表达框中，获得PJ23119-phaAB质粒；以相同的方法，以运动假单胞菌(Pseudomonas)基因组为模板将phaC、pct两个基因采用多基因一步同源重组的方式，插入至Pj23119的表达框中，最后组合成PJ23119-phaABC-pCT；所述的PJ23119-phaABC-pCT质粒的构建方法为：以大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655基因组为模板，设计含有B0034RBS的引物，扩增获得含有B0034RBS的sulA基因，将该片段插入至pSC101质粒中，获得pSC101-sulA质粒。本专利技术的第二个目的是一种生产聚乳酸的方法，利用上述基因工程菌发酵生产聚乳酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵的培养基包括NBS无机盐培养基。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵的条件为35-38℃，200-220rpm，菌株发酵初始OD600为0.04-0.1，发酵70-100h；或，所述发酵的条件为35-38℃，480-530rpm，接种量为5-10％，装液量为30-50％，pH为6.0-7.0，菌株发酵初始OD600为0.04-0.3，通气量为1-2vvm，发酵70-100h。本专利技术的第三个目的是提供上述的一种基因工程菌或上述的一种生产聚乳酸的方法在制备目的蛋白中的应用，所述目的蛋白包括酶蛋白或非酶蛋白。本专利技术的第四个目的是提供上述的一种基因工程菌或上述的一种生产聚乳酸的方法在生物、制药、食品或化工领域内的应用。有益效果：本专利技术提供了一种构建调控基因线路的方法。此外，该方法设计简单，系统元件少，菌株生长负荷低。通过构建聚乳酸生产工程菌株和引入调控基因线路，聚乳酸含量高达53.8w％，具有较好的应用前景。附图说明图1：调控细胞形态的细胞参数。图2：聚乳酸的生产路径。图3：质粒图谱，PJ23119-phaABC-pCT和pSC101-sulA。图4：摇瓶中聚乳酸含量的变化。图5：7.5L发酵罐中聚乳酸含量的变化。具体实施方式材料与方法质粒构建采用经典分子生物手段进行。细胞形态学参数检测使用荧光显微镜(Nikonmicroscop,80i)进行测定，控制环境温度30度。种子培养基：LB培养基，成分包含蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。发酵培养基：NBS无机盐培养基，成分包含葡萄糖50g/L、CaCl2·2H2O15mg/L、微量元素液0.667mL/L、灭菌后补加MgSO4·7H2O0.25g/L，VB10.5mg/L，盐酸甜菜碱1mM。微量元素液的配置方法为FeCl3·6H2O2.4g/L、CoCl2·6H2O0.3g/L、CuCl20.15g/L、ZnCl2·4H2O0.3g/L、NaMnO40.3g/L、H3BO30.075g/L、MnCl2·4H2O0.5g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因工程菌，其特征在于，表达调控细胞大小的靶点基因和调控聚乳酸生产的靶点基因；所述调控细胞大小的靶点基因包括编码细胞分裂抑制剂SuaA的基因sulA，所述细胞分裂抑制剂SuaA的氨基酸序列与SEQ ID NO.1编码的氨基酸序列一致；所述调控聚乳酸生产的靶点基因包括编码酮酯宪硫解酶phaA的基因phaA，编码乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB的基因phaB，编码聚羟基丁酸合酶phaC的基因phaC和编码丙酰辅酶A转移酶pCT的基因pct；所述酮酯宪硫解酶phaA的氨基酸序列与SEQ ID NO.2编码的氨基酸序列一致，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.3编码的氨基酸序列一致，所述聚羟基丁酸合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.4编码的氨基酸序列一致，所述丙酰辅酶A转移酶pCT的氨基酸序列与SEQ ID NO.5编码的氨基酸序列一致。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，表达调控细胞大小的靶点基因和调控聚乳酸生产的靶点基因；所述调控细胞大小的靶点基因包括编码细胞分裂抑制剂SuaA的基因sulA，所述细胞分裂抑制剂SuaA的氨基酸序列与SEQIDNO.1编码的氨基酸序列一致；所述调控聚乳酸生产的靶点基因包括编码酮酯宪硫解酶phaA的基因phaA，编码乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB的基因phaB，编码聚羟基丁酸合酶phaC的基因phaC和编码丙酰辅酶A转移酶pCT的基因pct；所述酮酯宪硫解酶phaA的氨基酸序列与SEQIDNO.2编码的氨基酸序列一致，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的氨基酸序列与SEQIDNO.3编码的氨基酸序列一致，所述聚羟基丁酸合酶的氨基酸序列与SEQIDNO.4编码的氨基酸序列一致，所述丙酰辅酶A转移酶pCT的氨基酸序列与SEQIDNO.5编码的氨基酸序列一致。


2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以乳酸生产菌株GL0002为宿主。


3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述调控细胞大小的靶点基因和调控聚乳酸生产的靶点基因的表达方式为游离表达。


4....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，丁强，陈修来，李洋，刘佳，罗秋玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32