一种转化合成左旋多巴效率提高的大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种转化合成左旋多巴效率提高的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术以大肠杆菌为宿主，pET系列质粒为载体，在胞内异源表达酪氨酸酚裂解酶和PdxST酶，构建酪氨酸酚裂解酶和辅因子5‑磷酸吡哆醛的共表达重组菌株，并引入核糖开关在翻译水平上调控胞内辅因子5‑磷酸吡哆醛的代谢水平。以构建重组菌株为生物催化剂进行全细胞转化，可使左旋多巴产量达到106.1g/L，相比对照菌株提高了2.3倍，且生产强度可提高至21.2g/L/h，对底物邻苯二酚的转化率高达98.7％，具有重要的工业化应用前景。

An E.coli with high efficiency of transforming and synthesizing levodopa and its application

【技术实现步骤摘要】
一种转化合成左旋多巴效率提高的大肠杆菌及其应用
本专利技术涉及一种转化合成左旋多巴效率提高的大肠杆菌及其应用，属于生物工程

技术介绍
酪氨酸酚裂解酶(Tyrosinephenol-lyase，TPL，EC4.1.99.2)能够以丙酮酸钠、铵盐、邻苯二酚为底物合成左旋多巴，反应具有可逆性，需要PLP为辅因子。该酶广泛存在于假单胞菌属、真菌、链霉菌等微生物中，其中草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)中的酪氨酸酚裂解酶活性较高。5-磷酸吡哆醛(PLP)不仅作为辅因子与酶形成复合物进行催化反应，而且在维持菌体的正常生长中起到了重要作用。在酪氨酸酚裂解酶(TPL)催化合成左旋多巴的反应中，PLP与四聚体TPL活性中心的氨基酸Arg100、Phe123、Asp214、Arg217、Lys257结合形成具有催化活性的TPL-PLP复合物。左旋多巴产量并非与PLP浓度呈正相关，PLP浓度在30μM-90μM范围内最佳，而且过多地积累PLP与L-DOPA形成复合物，因此如何避免外源添加辅因子PLP，如何调控胞内辅因子PLP的合成水平是目前存在的问题。
技术实现思路
要解决的问题上如何通过胞内辅因子PLP合成途径避免外源添加辅因子PLP，并实现对胞内辅因子PLP的合成水平的调控。目标是获得既能够表达酪氨酸酚裂解酶又能够提高胞内辅因子PLP积累水平的用于转化合成左旋多巴的重组大肠杆菌，并且实现了对胞内辅因子PLP合成量在翻译水平的自反馈调控，利用获得的重组菌全细胞转化生产左旋多巴。本专利技术的第一个目的是提供一种转化合成左旋多巴效率提高的菌株，其特征在于，共表达编码酪氨酸酚裂解酶(TPL)与谷氨酰胺酰胺基转移酶亚基(Glutamineamidotransferaseforpyridoxalphosphatesynthesis,PdxST)的基因，加强辅因子5-磷酸吡哆醛(PLP)的再生，并在pdxST基因对应的SD区上游引入核糖开关调控辅因子PLP的合成量。在一种实施方式中，编码所述酪氨酸酚解酶的基因GeneID为838144，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在一种实施方式中，编码所述谷氨酰胺酰胺基转移酶亚基的基因pdxST的GeneID为KR821087.1，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在一种实施方式中，编码所述核糖开关的基因thiM的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在一种实施方式中，编码所述核糖开关的基因thiC的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在一种实施方式中，所述菌株以大肠杆菌为宿主。本专利技术的第二个目的是提供一种构建所述菌株的方法，其特征在于，PCR扩增编码PdxST酶的基因pdxST的基因，克隆到质粒pET-28-TPL(E313M)(质粒的构建方法记载于公开号为CN109897845A的专利申请文件中)，构建重组质粒pET-TPLST，并引入核糖开关构建重组质粒pET-TPLST-Ribo1转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。本专利技术的第三个目的是提供一种制备左旋多巴的方法，是以上述任一所述的菌株作为细胞催化剂，以15-20g/L丙酮酸、8-12g/L邻苯二酚、20-35g/L铵盐为底物，以Na2SO32-4g/L与EDTA1-2g/L作为抗氧化剂进行转化反应。在一种实施方式中，所述细胞催化剂的添加量为9-10菌体干重/L反应液。在一种实施方式中，所述细胞催化剂按下述方式制备：将上述任一所述的菌株在36-37℃下发酵2-3h，再加入诱导剂0.3-0.4mM的IPTG并降温至20-25℃，继续发酵10-11h，离心，收集菌体细胞。在一种实施方式中，所述发酵用的发酵培养基组成为：蛋白胨10-20g/L，酵母提取物20-30g/L，甘油2-8mL/L，配制900ml；各组分溶解后高压灭菌，冷却到60-80℃，再加100mL灭菌的10-20mmol/LKH2PO4和50-100mmol/LK2HPO4的溶液。在一种实施方式中，所述收集菌体的条件为：4-10℃条件下4000-6000rpm离心10-15min收集菌体。在一种实施方式中，所述转化反应体系用氨水调节pH为8.0-8.5。在一种实施方式中，所述反应过程还补加丙酮酸和邻苯二酚；配制的丙酮酸母液和邻苯二酚母液均为200g/L，丙酮酸母液和邻苯二酚母液补加速率相同，在反应1-2h为40-50ml/h，在反应2-4h为10-30ml/h，在反应4-5h为10-20ml/h，在反应过程中维持丙酮酸和邻苯二酚浓度均不超过10g/L，于15-18℃、180-200rpm转化4-6h。本专利技术还要求保护所述菌株或菌株的固定化制剂在制备左旋多巴或含左旋多巴的产品中的应用。有益效果：本专利技术构建了一株共表达酪氨酸酚裂解酶和PdxST酶的重组菌，并提供了利用该重组菌全细胞转化生产左旋多巴，其中重组菌BL21-TPLST-Ribo1生产左旋多巴产量达到106.1g/L，相比对照菌株提高了2.3倍，而且L-DOPA的生产强度提高到21.2g/L/h，对底物邻苯二酚的转化率高达98.7％，为代谢工程改造大肠杆菌生产左旋多巴奠定了基础。附图说明图1(a)为构建重组质粒示意图；图1(b)为核糖开关调控机理图。图2为PLP浓度对左旋多巴产量的影响。图3为不同菌株胞内蛋白表达情况；其中，泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11分别表示BL21-TPL(E313M)，BL21-ST1，BL21-ST2，BL21-ST3，BL21-ST4，BL21-TPLST1,BL21-TPLST2，BL21-TPLST3,BL21-TPLST4，BL21-TPLST-Ribo1,BL21-TPLST-Ribo2的胞内蛋白表达。图4(a)为不同菌株的辅因子PLP合成量；(b)为不同菌株转化的左旋多巴产量。具体实施方式表1PCR引物注：粗体碱基表示酶切位点，下划线碱基表示同源臂。表2构建表达蛋白的菌株胞内的PLP合成量的测定方法：将细胞悬浮于PB(pH8.0)缓冲液，稀释到适宜浓度，置于冰水混合物，超声破碎。待细胞完全破碎后，12000rpm，4℃，离心10min去除沉淀，取上清液使用安捷伦HPLC检测PLP。收集上清后用0.22μm滤膜过滤，稀释至适宜浓度，荧光检测器，激发姑光300nm，吸收光400nm，C18柱(4.6×250mm)，流动相为0.1M的高氯酸钾、0.5g/L的亚硫酸钠、0.1M的磷酸二氢钾，磷酸调pH至3，0.8mL/min流速，柱温30℃，检测时间15min。左旋多巴含量的测定方法：反应液离心收集上清后用0.22μm滤膜过滤，过滤后的样品利用安捷伦HPLC系统进行检测，色谱柱为C18柱(4.6×250mm)，流动相为蒸馏水和甲醇，280nm紫外检测。检测条本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大肠杆菌，其特征在于，共表达酪氨酸酚裂解酶与谷氨酰胺酰胺基转移酶亚基，并在编码谷氨酰胺酰胺基转移酶亚基的基因对应的SD区上游引入核糖开关。/n

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌，其特征在于，共表达酪氨酸酚裂解酶与谷氨酰胺酰胺基转移酶亚基，并在编码谷氨酰胺酰胺基转移酶亚基的基因对应的SD区上游引入核糖开关。


2.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于，编码所述酪氨酸酚解酶的基因含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；编码所述谷氨酰胺酰胺基转移酶亚基的基因含有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌，其特征在于，编码核糖开关的基因含有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。


4.根据权利要求1～3任一所述的大肠杆菌，其特征在于，以E.coliBL21、E.coliBL21(DE3)、E.coliJM109、E.coliDH5α或E.coliTOP10为宿主。


5.一种构建权利要求1～4任一所述大肠杆菌的方法，其特征在于，将编码谷氨酰胺酰胺基转移酶亚基的基因克隆到质粒pET-28-TPL(...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，韩红梅，曾伟主，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32