一株高产丙二酰辅酶A的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一株高产丙二酰辅酶A的基因工程菌及其构建方法和应用，所述基因工程菌由敲除大肠杆菌基因组中ldhA、pta、frdA、poxB、adhE五个基因，再导入丙二酰辅酶A合成途径基因，包括大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因，肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因和谷氨酸棒状杆菌的生物素连接酶基因构建而成。本发明专利技术基因工程菌通过对工程菌内部乙酰辅酶A流出途径进行抑制，并将丙二酰辅酶A合成途径构建到不同的表达载体转入工程菌，实现丙二酰辅酶A的高效积累，该工程菌可以以大肠杆菌的代谢副产物乙酸为底物，高效合成黄酮类化合物的前体物质丙二酰辅酶A，并利用该菌提高微生物法合成黄酮类化合物骨架前体物质柚皮素的产量。

A gene engineering strain with high yield of malonyl COA and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一株高产丙二酰辅酶A的基因工程菌及其构建方法和应用
本专利技术属于基因重组
，具体涉及一株高产丙二酰辅酶A的基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
丙二酰辅酶A(MalonylcoenzymeA)又称丙二酸单酰辅酶A，是一种辅酶A的衍生物，是微生物必须代谢途径中的关键化合物。在大肠杆菌(Escherichiacoli)代谢网络中，以葡萄糖为碳源，经过糖酵解途径生成乙酰辅酶A，大部分乙酰辅酶A经过柠檬酸循环代谢为二氧化碳和水，少部分乙酰辅酶A通过脂肪酸代谢途径被乙酰辅酶A羧化酶转化为丙二酰辅酶A，广泛参与到脂质、碳水化合物和氨基酸等多种重要物质的代谢活动中。同时，丙二酰辅酶A还是重要的信号分子，在许多生物体内参与脂质生物合成的转录调控和脂肪酸生物合成的转录调控。丙二酰辅酶A在动植物体内均广泛参与多种代谢产物的合成。在脂肪酸合成中丙二酰辅酶A为脂肪酸提供二碳单位，将脂肪酸碳链延伸两个碳单位。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中存在丙二酰辅酶A-FapR的调控系统，当胞内丙二酰辅酶A浓度充足时会解开FapR对脂肪酸合成基因的抑制，促进脂肪酸合成基因表达。同时丙二酰辅酶A参与了动物体内脂肪的沉积活动，乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A在脂肪酸合酶的催化下转变为甘油三酯，丙二酰辅酶A作为脂肪代谢的重要中间产物，在脂肪细胞的代谢过程中也起着重要的调控作用。丙二酰辅酶A还参与了植物体内黄酮类化合物、多酮类化合物的合成，利用相关途径基因的组装可以在微生物体内实现这些高值化合物的微生物法合成，受限于微生物胞内较低的丙二酰辅酶A浓度，丙二酰辅酶A成为微生物法合成姜黄素、柚皮素、白藜芦醇等高价值化合物的关键限速前体物质，其中黄酮类化合物因具有极高的药理功能而受到广泛关注。为了提高胞内丙二酰辅酶A的浓度，突破黄酮类化合物微生物法合成瓶颈，前人已经做了许多尝试。大肠杆菌通过乙酰辅酶A羧化酶将胞内乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶，大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶包括生物素羧化酶亚基、生物素羧基载体蛋白亚基(BCCP)、羧基转移酶α和β亚基共四个亚基，Lu等通过过表达大肠杆菌自身的乙酰辅酶A羧化酶，提高了胞内乙酰辅酶A转化效率，提高了胞内丙二酰辅酶A的含量。但是有研究表明大肠杆菌的生物素羧基载体蛋白亚基会对胞内乙酰辅酶A羧化酶形成负反馈调节，降低胞内乙酰辅酶A羧化酶含量。因此Miyahisa等通过过表达谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)由accBC和dtsR1基因编码的两个乙酰辅酶A羧化酶亚基大幅提高胞内丙二酰辅酶A的浓度，使柚皮素和生松素产量达到60mg/L。胞内乙酰辅酶A参与柠檬酸循环，也是重要的中间代谢产物，过表达乙酰辅酶A羧化酶必然会影响到胞内乙酰辅酶A的供给，因此Leonard等通过过表达乙酰辅酶A合成酶将大肠杆菌代谢的副产物乙酸转化为乙酰辅酶A，为丙二酰辅酶A合成提供充足的前体物质。乙酸在体系中部分电离，未电离的乙酸进入细胞会减弱质子推动力，影响ATP的生成进而影响菌体生长和重组蛋白的表达，这一途径在降低了环境中乙酸的浓度的同时又保证了胞内乙酰辅酶A的供给。在大肠杆菌代谢网络中，乙酰辅酶A也会流向一些非必需的副产物，导致胞内乙酰辅酶A含量的降低。这些研究均一定程度上提高了微生物胞内的丙二酰辅酶A的含量，但是对于途径的相关基因缺乏深入的挖掘，对于多种途径缺少有效的整合。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一株高效积累丙二酰辅酶A的基因工程菌，本专利技术产丙二酰辅酶A的基因工程菌为经过底盘微生物改造的产丙二酰辅酶A的基因工程菌，通过对工程菌内部乙酰辅酶A流出途径进行抑制，并将丙二酰辅酶A合成途径构建到不同的表达载体转入工程菌，实现丙二酰辅酶A的高效积累。本专利技术的工程菌可以以大肠杆菌的代谢副产物乙酸为底物，高效合成黄酮类化合物的前体物质丙二酰辅酶A，并利用该菌突破黄酮类化合物合成途径的瓶颈，提高微生物法合成黄酮类化合物的效率。本专利技术还提供一株高产丙二酰辅酶A的基因工程菌的构建方法和应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一株高产丙二酰辅酶A的基因工程菌，所述基因工程菌由敲除大肠杆菌基因组中ldhA、pta、frdA、poxB、adhE五个基因，再导入丙二酰辅酶A合成途径基因构建而成，所述丙二酰辅酶A合成途径基因包括大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因acs，肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因基因seaccACD和谷氨酸棒状杆菌的生物素连接酶基因cgbirA，所述肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因seaccACD包括三个亚基seaccA、seaccC、seaccD。其中，所述ldhA(GeneID:946315)、pta(GeneID:946778)、frdA(GeneID:948667)、poxB(GeneID:946132)、adhE(GeneID:945837)五个基因分别为流向乳酸的竞争代谢途径相关基因ldhA，流向乙酰磷酸的竞争代谢途径相关基因pta，流向琥珀酸的竞争代谢途径相关基因frdA，流向乙酸的竞争代谢途径相关基因poxB，流向乙醇的竞争代谢途径相关基因adhE。其中，所述大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因acs转录翻译合成乙酰辅酶A合成酶将乙酸转化为乙酰辅酶A；肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因seaccACD转录翻译合成乙酰辅酶A羧化酶将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A；谷氨酸棒状杆菌的生物素连接酶基因cgbirA转录翻译合成生物素连接酶辅助提高乙酰辅酶A羧化酶的活力。本专利技术所述产丙二酰辅酶A的基因工程菌为经过底盘微生物改造的产丙二酰辅酶A的基因工程菌，所述底盘微生物改造包括对ldhA、pta、adhE、poxB、frdA基因进行了敲除；同时在工程菌内部构建了一个全新的丙二酰辅酶A的合成途径和全新的丙二酰辅酶A合成途径基因，所述丙二酰辅酶A合成基因包括大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因acs，肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶亚基seaccA、seaccC、seaccD，谷氨酸棒状杆菌的生物素连接酶基因cgbirA。本专利技术中ldhA、pta、adhE、poxB、frdA基因为乙酰辅酶A流向乳酸、乙酰磷酸、乙醇、乙酸和琥珀酸的基因，敲除后抑制了乙酰辅酶A的流出，提高了胞内乙酰辅酶A的含量，乙酰辅酶A作为丙二酰辅酶A的直接前体物质，可以间接提高胞内丙二酰辅酶A的含量；大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶Acs可以将代谢副产物乙酸转化为乙酰辅酶A，进一步提高胞内乙酰辅酶A的含量，肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶SeaccACD可以将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A，提高胞内丙二酰辅酶A的含量。谷氨酸棒状杆菌的生物素连接酶CgbirA可以协助SeaccACD发挥活力，进一步提高胞内丙二酰辅酶A的含量。丙二酰辅酶A含量从0.085nmol/mgDCW提升至0.812nmol/mgDCW。本专利技术所述的丙二酰辅酶A合成途径，所述途径包括由乙酰辅酶A合成酶将微生物的代谢副产物乙酸合成乙酰辅酶A，提高胞内乙酰辅酶A的含量，然后利用乙酰辅酶A羧化酶将乙酰辅酶A转化为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高产丙二酰辅酶A的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由敲除大肠杆菌基因组中ldhA、pta、frdA、poxB、adhE五个基因，再导入丙二酰辅酶A合成途径基因构建而成，所述丙二酰辅酶A合成途径基因包括大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因acs，肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因基因seaccACD和谷氨酸棒状杆菌的生物素连接酶基因cgbirA，所述肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因seaccACD包括三个亚基seaccA、seaccC、seaccD。/n

【技术特征摘要】
1.一株高产丙二酰辅酶A的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由敲除大肠杆菌基因组中ldhA、pta、frdA、poxB、adhE五个基因，再导入丙二酰辅酶A合成途径基因构建而成，所述丙二酰辅酶A合成途径基因包括大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因acs，肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因基因seaccACD和谷氨酸棒状杆菌的生物素连接酶基因cgbirA，所述肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因seaccACD包括三个亚基seaccA、seaccC、seaccD。


2.根据权利要求1所述高产丙二酰辅酶A的基因工程菌，其特征在于，所述ldhA、pta、frdA、poxB、adhE五个基因分别为流向乳酸的竞争代谢途径相关基因ldhA，流向乙酰磷酸的竞争代谢途径相关基因pta，流向琥珀酸的竞争代谢途径相关基因frdA，流向乙酸的竞争代谢途径相关基因poxB，流向乙醇的竞争代谢途径相关基因adhE。


3.根据权利要求1所述高产丙二酰辅酶A的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因acs转录翻译合成乙酰辅酶A合成酶将乙酸转化为乙酰辅酶A；肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因seaccACD转录翻译合成乙酰辅酶A羧化酶将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A；谷氨酸棒状杆菌的生物素连接酶基因cgbirA转录翻译合成生物素连接酶辅助提高乙酰辅酶A羧化酶的活力。


4.一种丙二酰辅酶A合成途径，其特征在于，所述途径包括由乙酰辅酶A合成酶将微生物的代谢副产物乙酸合成乙酰辅酶A，提高胞内乙酰辅酶A的含量，然后利用乙酰辅酶A羧化酶将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A，同时共表达生物素连接酶进一步提高乙酰辅酶A羧化酶的活力，将乙酰辅酶A高效转化为丙二酰辅酶A。


5.一种表达载体，其特征在于，优选包含权利要求1所述的大肠杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因acs，肠沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因seaccACD和谷氨酸棒状杆菌的生物素连接酶基因cgbirA。

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【专利技术属性】
技术研发人员：吴俊俊，周朋，包美娇，董明盛，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32