【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及胺脱氢酶突变体及非α-氨基酸的合成方法，属于生物催化工程领域。
技术介绍
1、根据氨基在碳链上的位置不同，氨基酸可分为α-氨基酸和非α-氨基酸。手性非α-氨基酸在生物技术和精细化工领域有着重要的应用。在制药领域，手性非标准氨基酸是畅销药物的手性基石，如durutevir中的(r)-3-氨基丁酸和某些神经药物中的(r)-4-氨基戊酸(图1中的a)。此外，非α-氨基酸参与肽链折叠，使肽具有抑制蛋白-蛋白相互作用等功能特性。将非α-氨基酸加入酶中，突破了遗传密码只能含有22种天然氨基酸的限制，从而可以设计出效率和特异性更高的生物催化剂，并根据应用需求创造出人工酶。非α-氨基酸可转化为内酰胺，如吡咯烷，是药物、染料和油墨中的关键支架和中间体，也可用作溶剂和表面活性剂。巨大的市场需求凸显了开发新的手性非α-氨基酸合成途径的重要性。
2、手性非α-氨基酸的化学合成面临着巨大的挑战，因为需要在氨基连接的碳原子上精确的手性构型。此外，氨基和羧基在化学合成过程中容易受到破坏，因此需要对其进行保护。传统的非α-氨基酸的化学合成通常采用化学或金属催化剂进行还原性胺化或不对称氢化，这可能对环境不友好，并且具有不一致的立体选择性。近年来，非α-氨基酸的酶不对称合成取得了重大成就，与传统的化学方法相比，提供了一种更温和、更可持续的方法(图1中的b)。氨基转移酶介导的β-氨基酸合成，涉及氨基转移到β-酮酸羰基，由于平衡约束和需要有机胺供体，成本高且效率低。最近，我们通过底物特异性修饰策略成功合成了γ-氨基酸，该策略涉及改变ecglu
3、底物工程是调整底物-酶相互作用的关键策略。先前的研究已经证明了其在扩大底物范围和增强对映体选择性方面的功效。在有机合成中，boc、fmoc和sem等保护基团被用来暂时抑制官能团的反应活性，然后在反应后去除它们以产生所需的产物。这个概念可以转移到酶合成，其中非极性基团修饰可以掩盖底物和氨基酸残基之间的强极性相互作用。这种方法绕过了羧基诱导的底物取代位置限制，随后通过简单的化学脱保护便可以获得目标产物。利用酯基来屏蔽羧基诱导的极性作用是底物工程中的一个关键策略，因此需要寻找能够催化酮酯还原胺化的酶。
4、胺脱氢酶(amdhs)，包括广泛使用的氨基酸脱氢酶定向进化得到的工程胺脱氢酶及天然胺脱氢酶，它们通过不对称还原胺化催化手性胺的合成，利用具有成本效益的氨供体，实现高产物转化率和对映选择性。含有amdhs的级联催化体系已被开发用于手性胺的合成，具有优异的对映选择性。amdh可以催化侧链上具有非极性基团的小分子。这些研究包括改造底物结合位点以适应更大的非天然底物，将amdh活性扩展到包括双环和杂环酮。目前，amdhs对具有非极性侧链的底物表现出显著的催化潜力，满足催化非极性基团修饰底物的要求。
技术实现思路
1、本研究设计了一种利用amdh的新型酶化学级联，以酮酯为底物合成具有不同取代位置的非α-氨基酸(图1中的c)。构建该级联的两个关键要素包括解除对取代位置的限制和增强amdh对酮酯的催化活性。基于底物工程，将羧基修饰为酯基，去除羰基取代位的限制。底物工程与酶的空间位阻修饰相结合，有效地提高了f-bbamdh对酮类酯的催化活性。β-、γ-、δ-和ε-氨基酸通过一系列酶促反应和化学水解合成。工程突变体丰富了绿色合成非α-氨基酸的工具箱。
2、本专利技术提供了一种苯丙氨酸胺脱氢酶突变体，所述苯丙氨酸胺脱氢酶突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的苯丙氨酸胺脱氢酶的第50位、第124位、第144位、第306位、第309位、第313位中的一个或多个氨基酸进行突变后得到的。
3、seq id no.1：
4、mslvektsiikdftlfekmseheqvvfcndpatglraiiaihdttlgpalggcrmqpynsveealedalrlskgmtyscaasdvdfgggkaviigdpqkdkspelfrafgqfvdslggrfytgtdmgtnmedfihamketncivgvpeayggggdssiptamgvlygikatnkmlfgkddlggvtyaiqglgkvgykvaeglleegahlfvtdineqtleaiqekakttsgsvtvvasdeiysqeadvfvpcafggvvndetmkqfkvkaiagsalnqlltedhgrhladkgilyapdyivnsggliqvadelyevnkervlaktkhiydailevyqqaeldqittmeaanrmceqrmaargrrnsfftssvkpkwdirn
5、在本专利技术的一种实施方式中，编码亲本酶苯丙氨酸胺脱氢酶的核苷酸序列如seqid no.2所示。
6、seq id no.2：
7、atgtcgttggtggaaaaaacttcaatcattaaggatttcacactgttcgaaaagatgagtgaacatgagcaagttgtcttttgcaatgatcccgcaactggtttacgcgcgatcatcgctatccatgataccactttaggcccagcacttggaggatgtcgcatgcagccttacaatagtgtcgaagaggcattggaggacgcgttgcgcttgtcgaaaggcatgacatatagctgtgcggcctctgacgtggactttggcggcggcaaggcagtgattattggtgatccccaaaaggacaagtccccggagctgtttcgcgcatttggtcagttcgtggatagccttggaggacgtttttacacgggcacagatatggggaccaatatggaagactttattcacgcaatgaaggagacgaattgcatcgtcggagtaccggaggcttatggaggtggaggcgactcgtctattccgactgccatgggggtcctgtatggaatcaaggcaaccaataagatgttgttcggtaaggatgatttaggcggtgttacctacgcgatccagggccttggtaaggtggggtacaaagttgccgaaggtttacttgaagaaggggcacatttgtttgtaaccgatatcaacgaacaaactttagaagccatccaagagaaggca本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种苯丙氨酸胺脱氢酶突变体，其特征在于，所述苯丙氨酸胺脱氢酶突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的苯丙氨酸胺脱氢酶的第50位、第124位、第144位、第306位、第309位、第313位中的一个或多个氨基酸进行突变后得到的。
2.根据权利要求1所述的苯丙氨酸胺脱氢酶突变体，其特征在于，所述苯丙氨酸胺脱氢酶突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的苯丙氨酸胺脱氢酶的第50位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；
3.编码权利要求1或2所述的突变体的基因或携带所述基因的重组载体。
4.表达权利要求1或2所述突变体或携带权利要求3所述基因或所述重组载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
6.一种含有权利要求1或2所述苯丙氨酸胺脱氢酶突变体序列的重组酶催化剂，其特征在于，是以下形式中的任意一种：
7.一种提高苯丙氨酸胺脱氢酶对底物的活性的方法，其特征在于，所述底物为乙酰A酸B酯，其中，A为乙、丙、丁或戊，B为甲、乙、丙或丁；
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述潜手性酮酸酯类化合物的结构式包括但不限于：
10.权利要求1所述的突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组载体或权利要求4或5所述的重组细胞或权利要求6所述的重组酶催化剂或权利要求7所述的方法或权利要求8或9所述的方法在食品、生物材料、医药、添加剂或化妆品领域的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种苯丙氨酸胺脱氢酶突变体，其特征在于，所述苯丙氨酸胺脱氢酶突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的苯丙氨酸胺脱氢酶的第50位、第124位、第144位、第306位、第309位、第313位中的一个或多个氨基酸进行突变后得到的。
2.根据权利要求1所述的苯丙氨酸胺脱氢酶突变体，其特征在于，所述苯丙氨酸胺脱氢酶突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的苯丙氨酸胺脱氢酶的第50位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；
3.编码权利要求1或2所述的突变体的基因或携带所述基因的重组载体。
4.表达权利要求1或2所述突变体或携带权利要求3所述基因或所述重组载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
6.一种含有权利要求1或...
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