减毒重组工程菌及其制备方法、应用和肿瘤靶向药物技术

本发明专利技术公开了一种减毒重组工程菌及其制备方法、应用和肿瘤靶向药物，以relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌为载体，将编码ClyA基因的重组质粒转入至所述relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌中获得减毒重组工程菌。其制备方法包括：构建重组质粒、制备relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌、导入。减毒重组工程菌通过携带编码细胞溶素的质粒，在细菌靶向肿瘤后过量表达ClyA蛋白，通过破坏细胞膜的完整性，有效地杀死肿瘤基质细胞和肿瘤细胞，可应用于制备肿瘤靶向药物。

Attenuated recombinant engineering bacteria and its preparation, application and tumor targeting drugs

【技术实现步骤摘要】
减毒重组工程菌及其制备方法、应用和肿瘤靶向药物
本专利技术涉及医疗
，尤其涉及减毒重组工程菌及其制备方法、应用和肿瘤靶向药物。
技术介绍
胰腺癌(pancreaticcancer)是一种恶化恶性程度极高的消化系统肿瘤，其发病率和死亡率近年来在全球范围内呈明显上升趋势。目前对胰腺癌缺乏有效的早期诊断与治疗措施，导致胰腺癌患者整体5年生存率不足8％，给人类生命健康造成了严重威胁。根据我国国家肿瘤防控中心2018年发表数据表明：在2014年，我国有超过8万人死于胰腺癌，位居所有癌症第六位，仅次于肺癌、肝癌、胃癌、食道癌和结直肠癌。因此，对于胰腺癌的早期诊断及治疗药物的研发显得极具必要性和迫切性。由于生理结构的复杂性，以及缺乏相应的早期诊断措施，使得手术治疗仅适合不到20％的新发患者群体。化学疗法对于胰腺癌患者有一定的治疗效果，但同时也伴随着严重的副作用以及耐药性。近年来，免疫检查点疗法(immunocheckpointtherapy)已通过FDA的批准而被广泛应用于临床肿瘤患者的治疗。该类药物主要通过阻断抑制T细胞活化的信号通路，从而使T细胞被充分活化达到杀死肿瘤细胞的目的。尤其在黑色素瘤、非小细胞肺癌等肿瘤患者的治疗中，已取得了显著的临床效果。通过对肿瘤微环境的分析发现，对于T细胞浸润贫乏的肿瘤，包括胰腺癌、卵巢癌等这一类的“冷肿瘤”，免疫检查点疗法并无显著效果。胰腺癌组织中含有异常丰富的基质细胞(stromalcells)，这些基质细胞通过释放多种免疫抑制因子，包括转化生长因子β(TGF-β)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)等，抑制免疫细胞的活化，降低免疫治疗的效果。胰腺癌含有丰富的肿瘤基质细胞而加大了治疗难度，使肿瘤组织中免疫受到抑制，增强了肿瘤组织对抗癌药物的耐药性。由于当前治疗方案对胰腺癌并无显著的治疗效果，对于胰腺癌靶向治疗药物的研发迫切需要寻找新的方向。重组菌对实体瘤具有广谱的靶向性，如果细菌疗法能够靶向杀伤基质细胞或许能为临床胰腺癌患者治疗提供新的思路。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种减毒重组工程菌及其制备方法、应用和肿瘤靶向药物，减毒重组工程菌通过携带编码细胞溶素(CytolysinA,ClyA)的质粒，在细菌靶向肿瘤后过量表达ClyA蛋白，通过破坏细胞膜的完整性，有效地杀死肿瘤基质细胞和肿瘤细胞，坏死的肿瘤组织细胞为细菌的生长、繁殖提供了丰富的营养物质，进一步强化炎症反应，提升对肿瘤的杀伤能力。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种减毒重组工程菌，其特征在于，以relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)为载体，将编码ClyA基因的重组质粒转入至所述relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌中获得减毒重组工程菌。基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了上述的减毒重组工程菌的制备方法，包括以下步骤：S1、构建编码ClyA基因的重组质粒；S2、制备减毒的鼠伤寒沙门氏菌；S3、将所述重组质粒导入至减毒的鼠伤寒沙门氏菌中获得减毒重组工程菌。上述的制备方法，进一步的，所述S1具体包括以下步骤：S1-1、根据人的伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)基因组DNA设计引物对，进行PCR扩增获得扩增产物；S1-2、酶切所述扩增产物和原始载体得到酶切后的扩增产物和酶切后的原始载体；S1-3、将所述酶切后的扩增产物连接到所述酶切后的原始载体上得到重组质粒。上述的制备方法，进一步的，所述S1-1中所述引物对为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述的DNA序列。上述的制备方法，进一步的，所述S2具体包括以下步骤：S2-1、针对relA和spotT基因序列设计relA引物对和spoT引物对，以pKD4质粒作为relA引物对模板，以pKD3质粒作为spoT引物对模板进行PCR扩增得到扩增产物；S2-2、将所述S2-1中所述扩增产物通过电转化导入感受态细胞中，得到P22噬菌体；S2-3、通过P22噬菌体转导，在14028s野生菌株同源重组靶向删除relA、spoT基因，获得relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌。上述的制备方法，进一步的，所述relA引物对为SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所述的DNA序列；所述spoT引物对为SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所述的DNA序列。基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了上述的减毒重组工程菌在制备肿瘤靶向药物中的应用。上述的应用，进一步的，所述肿瘤靶向药物为胰腺癌靶向药物。基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种肿瘤靶向药物，包括权利要求1所述的减毒重组工程菌和阿拉伯糖。上述的肿瘤靶向药物，进一步的，所述减毒重组工程菌的浓度为0.5～2.5×109cfu/kg；所述阿拉伯糖的浓度为2～6g/kg。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)本专利技术提供了一种减毒重组工程菌，以减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)为载体，减毒鼠伤寒沙门氏菌(ppGpp)具有高度的肿瘤靶向特异性及良好的抑癌效果。同时，在减毒鼠伤寒沙门氏菌中导入表达ClyA基因的质粒，构建了高度弱化的非侵染性的合成缺陷的沙门氏菌突变体(ΔppGpp)，毒力仅是野生型细菌的百万分之一。这种细菌能够特异性地靶向多种肿瘤模型，且在肿瘤组织中的细菌浓度能达到脾脏、肝脏等正常组织浓度的一万倍以上(1×1010细菌/克肿瘤组织)，通过介导的胰腺癌靶向治疗，能够有效地抑制人的胰腺癌生长。(2)本专利技术提供了一种减毒重组工程菌的制备方法，为了增强对胰腺癌的治疗效果，重组工程菌通过在肿瘤组织中持续过量表达溶癌蛋白(ClyA)，有效地杀死肿瘤基质细胞以及肿瘤细胞。我们将细胞溶素基因(ClyA)克隆到阿拉伯糖诱导的pBAD启动子系统中，并将其成功导入减毒沙门氏菌中，体外实验表明减毒重组工程菌表达的ClyA具有很好的溶血活性。(3)本专利技术提供了一种肿瘤靶向药物，包括表达ClyA的减毒重组工程菌和阿拉伯糖，减毒重组工程菌能够非常特异性地定居肿瘤组织中，在阿拉伯糖的诱导下调控pBAD启动子以实现抗癌基因ClyA的可控化表达，在靶向杀死肿瘤的同时极大地降低了对正常组织的毒性，保持着对机体的高度安全性。同时，减毒重组工程菌治疗能够有效地促进免疫细胞在肿瘤组织中的浸润，同时破坏肿瘤基质细胞，降低免疫抑制信号，激活肿瘤免疫微环境，为临床胰腺癌治疗及联合疗法提供新的方法。附图说明为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1是本专利技术实施例3中用血平板和蛋白免疫印迹鉴定ClyA在体外的活性及表达情况图。图2是本专利技术实施例4中减毒重组工程菌在体内的分布及抗癌蛋白的表达情况图。图3是本专利技术实施例5中减毒重组工程菌对胰腺癌皮下肿瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种减毒重组工程菌，其特征在于，以relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)为载体，将编码ClyA基因的重组质粒转入至所述relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌中获得减毒重组工程菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种减毒重组工程菌，其特征在于，以relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)为载体，将编码ClyA基因的重组质粒转入至所述relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌中获得减毒重组工程菌。


2.一种权利要求1所述的减毒重组工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建编码ClyA基因的重组质粒；
S2、制备relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌；
S3、将所述重组质粒导入至relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌中获得减毒重组工程菌。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S1具体包括以下步骤：
S1-1、根据人的伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)基因组DNA设计引物对，进行PCR扩增获得扩增产物；
S1-2、酶切所述扩增产物和原始载体得到酶切后的扩增产物和酶切后的原始载体；
S1-3、将所述酶切后的扩增产物连接到所述酶切后的原始载体上得到重组质粒。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S1-1中所述引物对为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述的DNA序列。


5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S2具...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑金海，谭文芝，郭艳霞，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43