PD-1人源化单链抗体融合基因转化乳酸菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了PD‑1人源化单链抗体融合基因转化乳酸菌，包括PD1Fv基因或CTB‑PD1Fv融合基因转化乳酸菌，是将所述PD1Fv基因或CTB‑PD1Fv融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得。还公开了该转化菌在制备具有肿瘤免疫治疗效果的口服活菌药物中的应用。本发明专利技术中PD1Fv基因或CTB‑PD1Fv融合基因转化乳酸菌可制备成活菌悬液、乳制品、活菌菌粉、菌片或胶囊等活菌制剂，作为免疫治疗活菌药物口服后能在人体肠道内增殖和定植，应用于肿瘤、病毒感染或细胞内细菌感染、原发性和继发性免疫低下等疾病的预防与治疗。

Transformation of PD-1 human scFv fusion gene into Lactobacillus and its application

【技术实现步骤摘要】
PD-1人源化单链抗体融合基因转化乳酸菌及其应用
本专利技术属于生物药物
，具体涉及PD-1人源化单链抗体融合基因转化乳酸菌及其应用。
技术介绍
近年来，以免疫检查点(checkpoint)分子为靶点的免疫治疗是目前抗肿瘤研究的热点，多种免疫检查点抑制剂药物，如PD-1、PD-L1人源化抗体已经获准在临床应用，并获得了较好的疗效。恶性肿瘤之所以能逃避免疫监视，主要原因是恶性肿瘤细胞自身和免疫细胞都会表达一些免疫共抑制分子(co-inhibitorymolecular)，又称为免疫检查点(checkpoint)分子，产生免疫抑制，逃避机体的免疫监视。这也是肿瘤治疗需要突破的主要障碍。T细胞活化后会表达一系列免疫检查点分子，如细胞毒T细胞抗原4(CTLA-4)、受体程序性死亡因子1(programmeddeath1，PD-1)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(Tcellimmunoglobulin-3,TIM3)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyteactivationgene3，LAG-3，CD223)、T细胞含ITIM结构域的免疫球蛋白(TcellimmunoglobulinandITIMdomainprotein，TIGIT)等等。这些通过负反馈调节机制来控制免疫反应的强度和持续时间，防止过度免疫应答导致炎症反应和自身免疫性疾病。恶性肿瘤细胞自身，以及抗原递呈细胞(APC)、调节性T细胞(Treg)，抑制性免疫细胞等也表达一些免疫共抑制分子，参与免疫负调控。B7-H1(CD274)和B7-DC(CD273)是两个重要的免疫抑制分子，二者都是CD80(B7.1)的同源分子，都能与T细胞上的PD-1结合，抑制产生抗肿瘤免疫，抑制效应T细胞(Te)对肿瘤的杀伤作用。因而，二者又分别被称为PD-1配体1(PD-L1)和配体2(PD-L2)。PD-L1广泛表达于各种恶性肿瘤细胞，受干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子的上调。PD-L2则主要表达于DC、巨噬细胞、肥大细胞等。PD-1主要在活化成熟的T细胞上有表达。未被激活的T细胞几乎没有PD-1的表达，只有T细胞活化后，才有PD-1表达。此外，在胸腺的双阴性(CD4-CD8-)T细胞、活化的NK细胞、单核细胞和未成熟的朗格汉斯细胞，PD-1低表达。PD-1属于CD28家族成员，与毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)有20％的同源性。PD-1是由268个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，它的结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构、疏水的跨膜区以及胞内区。胞内区尾部有2个独立的酪氨酸残基，氮端的酪氨酸残基参与构成一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosinebasedinhibitorymotif，ITIM)，碳端酪氨酸残基则参与构成一个免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptortyrosinebasedswitchmotif，ITSM)。PD-1与PD-L1在激活的T细胞结合后，促使PD-1的ITSM结构域中的酪氨酸发生磷酸化，进而引起下游蛋白激酶Syk和PI3K的去磷酸化，抑制下游AKT、ERK等通路的活化，最终抑制T细胞活化所需基因及细胞因子的转录和翻译，发挥负向调控T细胞活性的作用。PD-L1和PD-L2都能与T细胞上的受体PD-1或者CD80结合。一方面抑制T细胞的活化，诱导T细胞凋亡；另一方面抑制Te细胞对肿瘤细胞产生的细胞毒作用。近年来，针对PD-1及其配体PD-L1、PD-L2，以及CTLA-4等免疫抑制分子的靶向治疗已经成为抗肿瘤治疗研究的热点。PD-1、PD-L1抗体通过与对应分子的结合，阻断了PD-1/PD-L1,2的结合，解除了PD-1/PD-L1对免疫细胞的抑制作用，提高了Te对肿瘤细胞的细胞毒作用。此外，解除PD-1/PD-L2的免疫抑制可以在一定程度上促进机体产生抗肿瘤主动免疫，增加Te细胞的数量。PD-1人源抗体nivolumab和pembrolizumab，PD-L1抗体atezolizumab最初用于恶性黑色素瘤治疗，已先后获得日本、美国和澳大利亚等国FDA批准上市。PD-1、PD-L1、PD-L2和CTLA-4的人源化抗体或抑制剂在乳腺癌、结肠癌和肺癌等恶性肿瘤的临床治疗试验中获得了可喜疗效，目前，已有2种PD-1抗体和3种PD-L1抗体获批在欧美等几十个国家临床应用。美国FDA后续又批准PD-1抑制剂用于恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈部肿瘤、霍奇金淋巴瘤、肝癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、Merkel细胞癌以及所有微卫星高度不稳定(MSI-H)的实体瘤的治疗。此外，PD-1抑制剂在结直肠癌、食管癌、三阴性乳腺癌、鼻咽癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤、神经内分泌肿瘤、恶性间皮瘤、非霍奇金淋巴瘤等其他多种实体瘤的治疗上，显示出了初步的、不错的疗效。在未经选择的实体瘤患者中，PD-1抑制剂的有效率只有10％-30％。经典型霍奇金淋巴瘤，有效率超过60％以上。绝大多数实体瘤(淋巴瘤除外)，PD-1抑制剂起效平均时间大约是2-4个月。因此，手术或同步放化疗后，巩固性、辅助性使用的病友，PD-1抑制剂建议用满1年；而晚期的、全身转移的病友，建议用满2年。用药以后，每隔6-8周做一次影像学复查。然而，现有检查点抑制剂，如PD-1、PD-L1抗体等免疫治疗药物存在生产成本高、用药不便两大固有缺点，限制了其在临床上推广使用。传统的生物药物(包括抗体)的生产都离不开蛋白的分离和纯化，必须注射途径给药，存在生产成本高和用药不便这两大固有缺点。如果采用传统的生产方式制备PD-1抗体，依然存在生产成本高、用药不便两大难于克服的问题。因此，有必要探索PD-1抗体新的表达生产方式和给药途径。胃肠道是最简便、经济的生物药物生成与转化的生物反应器，乳酸菌等益生菌是免疫治疗药物口服给药途径的良好载体。我们人体自身的胃肠道是一个复杂、动态的“微生态世界”,也是一个高效的生化代谢“工厂”。据估计,一个成人肠道内的细菌总数超过1014，其生化代谢的总量相当于肝脏的代谢总量。如果能有效地利用胃肠道这个“工厂”，把它作为一个药物生成与转化的生物反应器，无疑具有经济、便利、高效的优点，为疾病预防和治疗提供一条新途径。乳酸菌、双歧杆菌是肠道生物反应器最合适、最安全的宿主菌。乳酸菌、双歧杆菌等益生菌长期生长存在于口腔、阴道和人体消化道，尤其是下消化道(回肠、结肠)等缺氧部位，人体甚至把它们当成自身的一部分，基本不产生免疫排斥反应。益生菌具有改善肠道微生态环境、抑制致病菌生长，促进营养吸收、分解有毒产物、免疫调理和预防肿瘤发生等许多功能作用。乳酸菌、双歧杆菌在下消化道存留时间较长，数量多，并有累积效应，利于肽类药物表达和吸收利用，非常适合作为多肽药物在肠道内表达和给药的载体。近年来，利用基因工程益生菌进行口服疫苗制备或基因治疗成为研究热点。益生菌可用于表达轮状病毒抗原、破伤风毒素C等抗原制备口服疫苗，或表达胞嘧啶脱氨酶(CD)基因进行恶性肿瘤的基因治疗。利用乳酸菌等益本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.PD-1人源化单链抗体融合基因转化乳酸菌，包括PD1Fv基因或CTB-PD1Fv融合基因转化乳酸菌，是将所述PD1Fv基因或CTB-PD1Fv融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得，其中所述CTB-PD1Fv融合基因主要由PD1Fv基因和CTB基因连接而成，且在所述PD1Fv基因与所述CTB基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列，在所述PD1Fv基因和所述CTB-PD1Fv融合基因的N端引入分泌性信号肽SPK1序列。/n

【技术特征摘要】
1.PD-1人源化单链抗体融合基因转化乳酸菌，包括PD1Fv基因或CTB-PD1Fv融合基因转化乳酸菌，是将所述PD1Fv基因或CTB-PD1Fv融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得，其中所述CTB-PD1Fv融合基因主要由PD1Fv基因和CTB基因连接而成，且在所述PD1Fv基因与所述CTB基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列，在所述PD1Fv基因和所述CTB-PD1Fv融合基因的N端引入分泌性信号肽SPK1序列。


2.根据权利要求1所述的PD-1人源化单链抗体融合基因转化乳酸菌，其特征是：所述转化乳酸菌不含耐药基...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾位森，徐雪艳，范宏英，白杨，孟晓静，
申请(专利权)人：广州维生君生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44