本发明专利技术公开了一种抗禽流感H9N2病毒的单链抗体ScFv‑AIV及其制备方法和应用，以及编码该单链抗体的基因、含有该基因的载体和宿主细胞等。该抗禽流感H9N2病毒的单链抗体，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过接头肽连接而成，并可通过原核表达系统进行高效表达。单链抗体ScFv‑AIV的分子量约为28kD，能够特异识别禽流感H9N2病毒，阻断病毒与天然血清的结合，可进一步用于该病毒的诊断、治疗制剂的开发和抗原表位研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程制品
，具体涉及一种抗禽流感H9N2病毒的单链抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
禽流感(AvianInfluenza，AI)是A型流感病毒(AIV)所引起的禽类的一种急性高度接触性传染病。按其血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同，AIV可分为15个HA亚型和9个NA亚型。其中，禽流感病毒H9N2亚型是Homme等于1970年在火鸡中首次分离得到的，其在禽类中广泛分布，通过抑制宿主的免疫系统、协同其他致病微生物等方式危害禽类养殖，降低生产性能。我国自1998年以来，禽流感H9N2病毒已经大面积存在，造成蛋鸡群产蛋下降和其它鸡群生产性能下降，给养禽业带来巨大的经济损失。同时，禽流感H9N2病毒的广泛、长期存在对禽流感病毒的快速变异、重组等带来了潜在危险，如2013年3月底在上海和安徽两地率先发现了一种新型H7N9亚型禽流感病毒，其就是以禽流感H9N2亚型的6个内部基因与其他亚型禽流感病毒通过基因重排产生的。因此，对禽流感H9N2病毒进行持续的流行病学监测对禽养殖业的健康发展和维护人类的公共健康极其重要。抗体，是疫病研究、检测和治疗的重要工具。早期人们主要用小鼠、兔子和山羊等动物制备多克隆抗体和单克隆抗体。随着对免疫球蛋白基因结构的解析和各种基因工程技术的涌现，人们开始采用基因工程的手段筛选、制备抗体。噬菌体抗体库技术是其中一种重要的抗体制备方法，其原理是将抗体V区基因与丝状噬菌体衣壳蛋白基因连接，并表达在噬菌体表面，通过目的抗原对抗体库进行多轮亲和吸附、淘筛获得所需的特异性抗体。噬菌体抗体库技术避开了常规单抗制备的细胞融合、亚克隆等繁琐过程，可短期内开发大量抗体，成为新一代抗体制备的重要手段。噬菌体抗体库技术开发的单链抗体ScFv是具有完全抗体结合位点的最小抗体片段，为完整抗体的1/6，具有多种优点：(1)保持了抗体的特异性，大大减少了免疫原性；(2)无Fc段，可与酶或细胞因子及药物连接构建双功能抗体，利于治疗与诊断；(3)易于基因操作和基因工程的大量生产，如在大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等表达系统大量生产。鉴于禽流感H9N2病毒的巨大危害，通过噬菌体抗体库技术开发抗禽流感H9N2病毒的单链抗体ScFv无疑在该病毒诊断试剂开发、新型药物研究和抗原表位鉴定等方面具有重要的理论意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗禽流感H9N2病毒的单链抗体，从而弥补现有技术的不足。通过构建噬菌体展示单链抗体库，“富集-洗脱-富集”的循环操作，从中筛选得到一个抗禽流感H9N2病毒的单链抗体ScFv-IV，并经进一步改造获得单链抗体ScFv-AIV，并构建了表达单链抗体的基因工程菌，从而可以采用生物工程的方法大量的制备该单链抗体。本专利技术首先提供一种抗禽流感H9N2病毒的单链抗体，所述的单链抗体包含有：1)氨基酸序列为的SEQIDNO:1的单链抗体；2)对1)中序列进行取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的单链抗体。编码上述蛋白的一种基因，其一种核苷酸序列为SEQIDNO:2；作为优选，单链抗体的氨基酸序列为SEQIDNO:3；编码上述蛋白的一种基因，其一种核苷酸序列为SEQIDNO:4；本专利技术再一个方面提供一种用于表达上述禽流感H9N2病毒的单链抗体的重组表达质粒，插入有上述的编码基因；本专利技术另一个方面提供一种重组宿主菌，携带有上述的重组表达质粒；本专利技术还提供一种抗禽流感H9N2病毒单链抗体的制备方法，其制备步骤如下：1)将抗禽流感H9N2病毒的单链抗体基因连入表达载体中，构建成表达重组质粒；2)将构建的表达重组质粒转化宿主菌，构建了能表达抗禽流感H9N2病毒的重组基因工程菌；用该重组基因工程菌表达出该单链抗体；3)对重组表达的单链抗体进行纯化后，能用来开发禽流感H9N2病毒的诊断、治疗制剂。本专利技术利用pET30a(+)表达性载体构建了能表达抗禽流感H9N2病毒单链抗体的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了28kD左右的重组目的蛋白。将重组蛋白纯化后可用于禽流感H9N2病毒的诊断、预防和治疗。具体实施方式下面结合具体实施方式来进一步描述本专利技术，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的技术方案的情况下可以对本专利技术的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本专利技术保护范围内。实施例1抗禽流感H9N2病毒噬菌体单链抗体库的构建1、将超速离心获得的禽流感H9N2病毒与弗氏完全佐剂1:1乳化后免疫BALB/c小鼠，加强免疫2次至抗体效价达1:100000以上。取小鼠脾脏，液氮研磨，按50-100mg脾脏加入1mlTrizol试剂，室温静置5min，加入0.2ml氯仿，反复剧烈振荡15s，室温静置2-3min。4℃，12000g/min离心15min，吸取水相于另一干净1.5ml的离心管中，加入0.5ml异丙醇颠倒混匀，于-20℃沉淀30-60min，12000g/min离心10min。保留沉淀，70％的乙醇洗涤1遍，空气中晾干，DEPC处理水溶解沉淀RNA。2、基因组DNA的去除和反转录合成cDNA(采用天根公司的FastQuantcDNA第一条链合成试剂盒)：2.1基因组DNA的去除：按下述体系配制基因组DNA去除体系，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min，然后置于冰上放置。5×gDNABuffer2μlRNA模板1μgRNase-FreeddH2O补足到10μl2.2cDNA的合成：按下述体系配制混合液，充分混匀。将上述基因组DNA的去除体系和反转录体系混合，充分混匀，42℃孵育15min。95℃孵育3min后放于冰上，得到的cDNA可用于后继试验。3、设计和合成的小鼠抗体轻、重链可变区扩增引物：扩增单链抗体重链VH的引物：VH上：5-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTC-3；VH下：5-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3。扩增单链抗体轻链VL的引物：VL上：5-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATYGAGCTCACYCAGTCTCC-3VL下：5-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTBAKYTCCARCTTKGTSCC-3。备注：B＝T、C、G；K＝T、G；M＝A、C；R＝A、G；S＝G、C；W＝A、T；Y＝C、T。用上述引物分别扩增上述cDNA模板，胶回收获得其轻、重链可变区基因片段。4、将上述扩增到的VH和VL基因片断分别用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离、回收，然后将VH和VL等量混合作为模板进行重叠延伸PCR(SOE-PCR)以装配ScFv片断，条件为94℃1min变性、55℃1min退火、72℃1min延伸，共30个循环。PCR产物即为单链抗体基因片断，VH和VL基因之间是15个氨基酸的linker序列：GGGGSGGGGSGGGGS。5、将胶回收的ScFv基因和pCANTAB5E载体分别双酶切(SfiI和NotI)后连接，将连接产物转化到100μlTG1感受态细胞，然后加入900本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗禽流感H9N2病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体包含有：1)氨基酸序列为的SEQ ID NO:1的单链抗体；2)对1)中序列进行取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的单链抗体。
【技术特征摘要】
1.一种抗禽流感H9N2病毒的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体包含有：1)氨基酸序列为的SEQIDNO:1的单链抗体；2)对1)中序列进行取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的单链抗体。2.一种核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段编码权利要求1所述的单链抗体。3.如权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQIDNO:2。4.一种抗禽流感H9N2病毒的单链抗体，其特征在于，所述的单链抗体的氨基酸序列为SEQIDNO:3。5.一种核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段编码权利要求4所述的单链抗体。6.如权利要求5所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：于春梅，王宏华，蒋贻海，凌红丽，薄宗义，杨光烈，丁江，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物制品有限公司，青岛动保国家工程技术研究中心有限公司，山东德利诺生物工程有限公司，青岛蔚蓝生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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