靶向JAML受体的单链抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种靶向JAML受体的单链抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或其保守型变异序列，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示或其保守型变异序列。单链抗体无FC段，不与非靶细胞的FC受体结合，单链抗体在体内清除快；单链抗体也有易于构建和表达，易于大批量制备等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种靶向JAML受体的单链抗体及其制备方法和应用，属于生物

技术介绍
JAML(junctionaladhesionmolecule–likeprotein)，作为JAMs(Junctionaladhesionmolecules)蛋白家族的一员，可以促进嗜中性粒细胞以及单核细胞到内皮细胞上的粘附，介导血液循环中的白细胞在炎症部位聚集的过程；JAML也可以介导γδT细胞的活化增殖，促使细胞分泌细胞因子IL-2、TNFα、IFN-g。因此JAML可作为免疫治疗的靶点，例如急性或慢性创伤修复等。目前已有文献发现HL4E10是针对于JAML受体靶点的外源刺激性抗体，HL4E10与JAML内源性受体CAR具有相同效应，两者结合后可使γδT细胞或者单核-巨噬细胞产生细胞因子、生长因子以及激活MAP通路的活化等，因此可引起细胞的增殖等效应。单链抗体是抗体可变区轻链(VL)和重链(VH)由一个肽链linker(10-15个氨基酸)链接区来连接的。完整抗体的相对分子质量较大，体内应用时难以穿越血管进入靶部位。单链抗体相对分子质量小，容易通过血管壁，容易穿透实体瘤，是导向药物首选的载体；单链抗体免疫原性弱，不易引起超敏反应和排斥反应；单链抗体无FC段，不与非靶细胞的FC受体结合，单链抗体在体内清除快；单链抗体易于构建和表达，易于大批量制备等优点。目前，尚未发现有靶向JAML受体的相关单链抗体的报道。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种靶向JAML受体的单链抗体及其制备方法和应用，用于解决现有技术中的不足。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种靶向JAML受体的单链抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:1所示或其保守型变异序列，其轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:2所示或其保守型变异序列。SEQIDNO:1具体的为:VLEPLSLTVISGWQGLMIATNLRIDKVKSQTYAFYVQQVSEQIDNO:2具体的为:SLPVAQTCDSYWQGPVERSPFSGATKAEYQDNWGTTGN优选地，其重链可变区和轻链可变区的连接区序列如SEQIDNO:3所示或其保守型变异序列。SEQIDNO:3具体的为GSGGG.本专利技术的另一个方面提供了一种分离的DNA分子，编码如权利要求1-2任一权利要求所述的抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸序列。所述DNA分子可以如SEQIDNO:4所示，所述SEQIDNO:4具体如下：GATATCCATCATCATCATCATCATAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGTTGCAGCCCTCACAGACCCTGTCTCTCACCTGCACTGTCTCTGGGATCTCATTATCGGACTATGGTGTACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGATGGGAATAATAGGTCATGCTGGAGGCACTGATTATAATTCAAATCTCAAATCCCGAGTCAGCATCAGCAGGGACACCTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAACTGAACAGTCTACAACAGGAGGACACAGCCATGTATTTCTGTGCTAGACATTTCTATACTTACTTTGATGTCTGGGGCCAGGGGATCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCAGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCTCATATACACTGACTCAACCTCCCTTAGTATCAGTGGCCCTAGGTCAAAAGGCCACAATCACCTGCTCTGGAGATAAACTCTCAGATGTGTATGTTCACTGGTATCAGCAGAAGGCAGGCCAGGCTCCTGTATTGGTCATATATGAAGATAATCGGCGTCCCTCTGGCATCCCAGACCACTTTTCTGGCTCCAACTCAGGGAACATGGCCACGCTGACCATCAGCAAAGCCCAGGCTGGAGATGAAGCTGACTATTACTGTCAATCTTGGGATGGTACTAATAGTGCTTGGGTGTTCGGTTCAGGCACCAAAGTGACTGTCCTAGGTCAGCCCAATTGAAAGCTT所述靶向JAML受体的单链抗体、分离的DNA分子也可通过现有技术利用化学合成的方法获得。本专利技术的另一个方面提供了一种构建体，包含如所述的分离的DNA分子。本专利技术的另一个方面提供了一种单链抗体表达的表达系统，由上述的构建体转染到宿主细胞构建而成。本专利技术的另一个方面提供了所述的靶向JAML受体的单链抗体的制备方法，包括如下步骤：(5)获得目的基因；(6)构建重组质粒：将步骤(1)所得的目的基因及其载体质粒采用相同的限制性内切酶切割，然后进行连接，获得重组质粒；(7)将步骤(2)所得的重组质粒转化宿主感受态细胞；(8)诱导表达单链抗体。优选地，所述步骤(2)中限制性内切酶为HindIII，EcoRV，所述载体质粒为pET-20b(+)。所述pET-20b(+)载体质粒根据现有技术获得。优选地，所述步骤(3)中所述感受态细胞为BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL感受态细胞。优选地，还包括步骤(5)分离纯化单链抗体：采用His-TagNi柱纯化单链抗体，然后采用分子筛层析法进一步纯化。本专利技术的另一个方面提供所述的靶向JAML受体的单链抗体在制备血液系统疾病、肿瘤、细菌性感染、血管动脉硬化、风湿性疾病治疗药物或诊断药物中的用途。所述血液系统疾病可以是再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、骨髓增生异常综合征、急性早幼粒细胞白血病等。所述肿瘤可以是胃癌、肺癌、肝癌等。如上所述，本专利技术的靶向JAML受体的单链抗体及其制备方法和应用，具有以下有益效果：(1)本专利技术首次对靶向JAML受体的HL4E10全抗进行单链抗体化改造，并且提供了HL-scfv的原核表达系统，使简单、大量制备抗JAML蛋白抗体成为可能，让靶向JAML的单链抗体HL-ScFv的应用更具有前景。(2)本专利技术使用分子筛层析法进一步纯化由His-TagNi柱纯化得到的蛋白，这样的纯化方法使得到的目的蛋白纯度更高，有利于接下来实验的开展。(3)本专利技术利用多种实验手段验证了HL-ScFv对细胞表面JAML受体的亲和活性，确保了最后得到的单链抗体分子较高的亲和活性、内化活性，为靶向JAML受体的临床应用奠定了基础。附图说明图1双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图图2WesternBlot检测超声破菌后粗提得到的HL-scFv图3蛋白粗提液的His-TagNi柱亲和层析图谱图4蛋白粗提液纯化后收集洗脱峰样品SDS-PAGE电泳图图5蛋白质分子筛层析图谱图6蛋白质分子筛层析纯化后收集洗脱峰样品SDS-PAGE电泳图图7流式细胞仪检测结果图具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向JAML受体的单链抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或其保守型变异序列，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示或其保守型变异序列。

【技术特征摘要】
1.一种靶向JAML受体的单链抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:1所示或其保守型变异序列，其轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:2所示或其保守型变异序列。2.根据权利要求1所述的靶向JAML受体的单链抗体，其特征在于：所述重链可变区和所述轻链可变区的连接区氨基酸序列如SEQIDNO:3所示或其保守型变异序列。3.一种分离的DNA分子，编码如权利要求1-2任一权利要求所述的抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸序列。4.一种构建体，包含如权利要求3所述的分离的DNA分子。5.一种单链抗体表达的表达系统，由权利要求4所述的构建体转染到宿主细胞构建而成。6.如权利要求1-2任一权利要求所述的靶向JAML受体的单链抗体的制备方法，包括如下步骤：(1)获得目的基因；(2)构建重组质粒：将步骤(1)所得的目的基因及其载体质粒采用相同的限制性内切酶切割，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宇虹，刘冬妮，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31