利用数字PCR检测马铃薯X病毒的方法及其专用成套试剂技术

本发明专利技术公开了利用数字PCR检测马铃薯X病毒的方法及其专用成套试剂。本发明专利技术所提供的成套试剂由引物对X1和探针PVX‑p组成；所述引物对X1由引物PVX‑f和引物PVX‑r组成；引物PVX‑f是序列表中序列1所示的单链DNA分子；引物PVX‑r是序列表中序列2所示的单链DNA分子；探针PVX‑p的序列为序列表中序列3，探针PVX‑p的5′末端具有FAM荧光标记，3′末端具有TAMRA荧光标记。实验证明，采用本发明专利技术所提供的方法数字PCR检测马铃薯X病毒，特异性好且灵敏度高，适用于潜隐病症和病毒含量低的样品中PVX的检测，具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
利用数字PCR检测马铃薯X病毒的方法及其专用成套试剂
本专利技术涉及生物
，具体涉及利用数字PCR检测马铃薯X病毒的方法及其专用成套试剂。
技术介绍
马铃薯是世界上种植和食用国家最多的作物，也是在全球经济中继水稻、小麦和玉米之后的第4大粮食作物。马铃薯是全世界的高产作物之一，中国种植马铃薯面积居全世界第一位。近年来，我国马铃薯产业发展迅速，马铃薯在我国国民经济增长中占有重要比重，但我国现阶段马铃薯整体生产水平低于世界平均水平，其主要原因便是受马铃薯病毒的影响。马铃薯X病毒(PotatovirusX，PVX)是马铃薯病毒之一，其分布广泛，在世界各马铃薯种植区均有发生。PVX是甲型线形病毒科(Alphaflexiviridae)、马铃薯X病毒属(Potexvirus)的典型成员，是由一条正链RNA组成的线性病毒，长度约为6.4kb，其RNA的3′末端是多聚腺嘌呤核苷酸，5′末端有m7GppG“帽子”结构。PVX的病毒粒子为长杆状，约515nm×13nm，自然条件下主要靠植株不同部位之间及植株间相互接触摩擦进行机械传播。PVX通常引起花叶症状，某些马铃薯品种感染轻微或潜伏起来，有的株系可能引起皱缩；某些马铃薯品种对特定的病毒株系过敏，反应为顶部坏死。据报道，PVX单独侵染马铃薯可降低产量15％左右。在田间，PVX也可与其它病毒混合侵染，其造成的危害更为严重，导致马铃薯的毁灭性减产。目前尚无有效的药剂可以防治PVX，因此，加强对PVX的快速精准检测是一个亟待解决的课题。同时脱除病毒和建立无病毒马铃薯快繁体系已成为马铃薯产业健康发展的有效保证，在脱毒马铃薯快繁体系中建立快速、有效的检测方法是重要的环节。目前，检测PVX的技术主要有传统生物学检测技术、免疫学检测技术、分子生物学检测技术等。传统生物学检测技术尽管检测的结果相当直观可靠，但是还是具有一些明显的不足，如灵敏度不高，工作量大，难以检测大量的样品。免疫学检测技术中常用的DAS-ELISA病毒病检测方法是利用血清学原理建立的，虽具有简单、快速的特点，非常适合应用在田间检测，但检测的结果存在着假阳性或假阴性现象，而且只是检测了病毒的外壳蛋白(CP)，其遗传信息量只占整个病毒遗传信息量的5％～10％，无法区分因CP基因有一定同源性的病毒类型，且存在不易检测含量极少的韧皮部病毒和不能检测休眠种薯中的病毒等方面的缺陷。分子生物学检测技术，如RT-PCR技术，相对于血清检测法不用制备抗体，而且省时又省力，已经用于PVX的检测，但对病毒浓度低的样品(如韧皮部样品和休眠未出芽或自然老的块茎)却不足以做出可靠的诊断。数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的PCR检测方法，其基本原理是通过将微量样品进行大倍数稀释和分液，直至每个样品中所含有的待测分子数不超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，有PCR扩增荧光信号记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子，针对反应结果采用泊松分布(Poissondistribution)公式，便可计算出样本的最初拷贝数或浓度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何检测马铃薯X病毒。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种检测马铃薯X病毒的成套试剂。本专利技术所提供的检测马铃薯X病毒的成套试剂，可由引物对X1和探针PVX-p组成；所述引物对X1可由引物PVX-f和引物PVX-r组成；所述引物对X1的靶序列含有特异DNA片段；所述特异DNA片段可为如下y1)或y2)：y1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；y2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述探针PVX-p可为20-30个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段中的部分区段相同。上述成套试剂中，所述引物PVX-f可为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子。上述成套试剂中，所述引物PVX-r可为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。上述成套试剂中，所述探针PVX-p可为如下c1)或c2)：c1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。上文中，所述y2)、所述a2)、所述b2)或所述c2)中，所述“经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加”可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述成套试剂中，所述探针PVX-p的末端可具有荧光标记。上述成套试剂中，所述探针PVX-p的末端具有荧光标记具体可为所述探针PVX-p的5′末端具有FAM荧光标记和/或3′末端具有TAMRA荧光标记。上述成套试剂中，所述引物PVX-f、所述引物PVX-r和所述探针PVX-p的摩尔比具体可为2：2：1。上述成套试剂中，所述引物PVX-f、所述引物PVX-r和所述探针PVX-p的量具体可如下：0.5μmol所述引物PVX-f、0.5μmol所述引物PVX-r和0.25μmol所述探针PVX-p。上述成套试剂中所述引物对X1也属于本专利技术的保护范围。上述引物对X1中，所述引物PVX-f和所述引物PVX-r的摩尔比具体可为1：1。上述引物对X1中，所述引物PVX-f和所述引物PVX-r的量具体可如下：0.5μmol所述引物PVX-f和0.5μmol所述引物PVX-r。c1)或c2)也属于本专利技术的保护范围：c1)上述成套试剂的制备方法，为将上述成套试剂中的所述引物PVX-f、所述引物PVX-r和所述探针PVX-p分别单独包装；c2)上述引物对X1的制备方法，为将上述引物对X1中各引物分别单独包装。上述成套试剂或上述引物对X1的应用也属于本专利技术的保护范围。上述成套试剂或上述引物对X1的应用可为如下d1)或d2)或d3)或d4)：d1)制备用于检测或辅助检测马铃薯X病毒的试剂盒；d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有马铃薯X病毒；d3)制备用于鉴定或辅助鉴定马铃薯X病毒的试剂盒；d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的马铃薯X病毒。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了含有上述成套试剂或上述引物对X1的试剂盒。所述试剂盒的应用也属于本专利技术的保护范围。所述试剂盒的应用可为如下d2)或d4)：d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有马铃薯X病毒；d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的马铃薯X病毒。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种检测待测样品是否含有马铃薯X病毒的方法。本专利技术所提供的检测待测样品是否含有马铃薯X病毒的方法，为A1)或A2)或A3)：A1)以待测样品的cDNA为模板，以所述成套试剂进行数字PCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述cDNA的数字PCR，则待测样品中含有或疑似含有马铃薯X病毒；如果所述成套试剂不能实现对所述cDNA的数字PCR，则所述待测样品不含有或疑似不含有马铃薯X病毒；A2)以待测样品的c本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测马铃薯X病毒的成套试剂，由引物对X1和探针PVX‑p组成；所述引物对X1由引物PVX‑f和引物PVX‑r组成；所述引物对X1的靶序列含有特异DNA片段；所述特异DNA片段为如下y1)或y2)：y1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；y2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述探针PVX‑p为20‑30个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段中的部分区段相同。

【技术特征摘要】
1.检测马铃薯X病毒的成套试剂，由引物对X1和探针PVX-p组成；所述引物对X1由引物PVX-f和引物PVX-r组成；所述引物对X1的靶序列含有特异DNA片段；所述特异DNA片段为如下y1)或y2)：y1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；y2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述探针PVX-p为20-30个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段中的部分区段相同。2.如权利要求1所述成套试剂，其特征在于：所述引物PVX-f为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物PVX-r为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述探针PVX-p为如下c1)或c2)：c1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。3.如权利要求1或2所述成套试剂，其特征在于：所述探针PVX-p的末端具有荧光标记。4.权利要求1或2所述成套试剂中的所述引物对X1。5.c1)或c2)：c1)权利要求1至3任一所述成套试剂的制备方法，为将权利要求1至3任一所述成套试剂中的所述引物PVX-f、所述引物PVX-r和所述探针PVX-p分别单独包装；c2)权利要求4所述引物对X1的制备方法，为将权利要求4所述引物对X1中各引物分别单独包装。6.权利要求1至3任一所述成套试剂或权利要求4所述引物对X1的应用，为如下d1)或d2)或d3)或d4)：d1)制备用于检测或辅助检测马铃薯X病毒的试剂盒；d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有马铃薯X病毒；d3)制备用于鉴定或辅助鉴定马铃薯X病毒的试剂盒；d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的马铃薯X病毒。7.含有权利要求1至3任一所述成套试剂或权利要求4所述引物对X1的试剂盒。8.权利要求7所述试剂盒的应用，为如下d2)或d4)：d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有马铃薯X病毒；d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的马铃薯X病毒。9.一种检测待测样品是否含有马铃薯X病毒的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永江，相宁，黄洁芳，王晨光，付伟，朱鹏宇，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11