单链胰岛素制造技术

本发明专利技术涉及具有胰岛素活性的单链胰岛素，其包含由5-11个氨基酸的连接肽连接的B和A链或修饰的B和A链。该单链胰岛素具有生物胰岛素活性和与人胰岛素的IGF-1相比类似或者更低的IGF-1受体亲和性以及高的物理稳定性。单链胰岛素在连接肽中可以含有至少一个碱性氨基酸残基。单链胰岛素还可以在一个或者多个Lys残基中被酰化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及单链胰岛素，它具有胰岛素的活性，可以用于糖尿病的治疗。单链胰岛素具有高的物理稳定性以及低的原纤维形成倾向，在中性PH下是可溶的。本专利技术还涉及了编码单链胰岛素的DNA序列、它们制备的方法以及含有单链胰岛素的药物组合物。
技术介绍
胰岛素是由胰腺的β -细胞分泌的多肽激素，由两个多肽链A和B组成，它们由链间二硫桥连接起来。此外，A链具有一个链内二硫桥。 该激素作为单链前体胰岛素原(前胰岛素原)合成，它由含24个氨基酸的前肽以及其后的含86个氨基酸的胰岛素原按照以下的构型组成』i_B_Arg Arg-C-Lys Arg-A,其中C是31个氨基酸的连接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是用于从A和B链切割连接肽形成双链胰岛素分子的切割位点。胰岛素在维持正常的代谢调控中是必需的。胰岛素的两条链结构使胰岛素可以呈现多种构象，一些发现已经表明胰岛素具有发生相当大的构象改变倾向，对这种改变能力的限制显著降低了胰岛素受体与配基的亲和性。与天然胰岛素相比，胰岛素原对胰岛素受体的亲和性降低了 100倍。封闭胰岛素中的氨基酸残基Al导致与受体结合较弱，这与“Α链的自由N端和B链的自由C端对于与胰岛素受体的结合是非常重要的”这个法则一致。胰岛素分子的内在物理和化学稳定性是糖尿病的胰岛素疗法的基本条件。这些基本性质对于胰岛素的形成和可应用的胰岛素给药方法，以及药物制剂的保存期和储存条件是重要的。在胰岛素的给药中溶液的使用使分子暴露于一些因素的组合中，例如升高的温度、可变的气液固界面以及剪切力，这些可以导致不可逆的构象改变例如原纤维形成。这对于滴注泵(无论是在体外携带还是移植的)中的胰岛素溶液是有重要意义的，滴注泵使胰岛素暴露在这些因子的组合中以及由于泵的长时间移动产生的剪切力中。因此在使用滴注泵作为胰岛素的给药系统时原纤维形成特别成为人们关注的问题。此外，胰岛素的溶解性受到多种因子的影响，在PH范围从4. 2到6. 6溶解性显著降低。pH沉淀区一般限制了制剂，但是在开发某些类似物的制剂中也被有意使用。因此，胰岛素的稳定性和溶解性性质对于目前的胰岛素治疗是重要的根本方面。本专利技术通过在B和A链之间引入C肽降低分子弹性，同时降低原纤维形成倾向并且限制或者改变PH沉淀区，以提供稳定的单链胰岛素类似物而解决这些问题。具有胰岛素活性的单链胰岛素在EP 1，193，272中公开。这些单链胰岛素具有5-18个氨基酸的修饰的C肽，据报道它们具有最多42%的胰岛素活性。EP 1，193，272公开了下列连接 B 30 和 A21 的修饰的 C 肽=Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg (SEQ ID NO 1),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :5)，Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :6)，Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO 8), Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :9)，和 Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO :10)。EP 741，188 公开的单链胰岛素具有 10-14 个氨基酸残基的修饰的C肽，并且具有14到34%胰岛素活性且具有以下连接肽Gln-PiO-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg(SEQ ID NO 11)和 Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr (SEQ ID N0:12)。WO 95/16708 公开了具有 1-15 个氨基酸残基的连接肽且连接肽中C末端氨基酸残基非Lys或Arg的单链胰岛素。WO 95/16708公开了以下的 C妝序列 Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr (SEQ ID NO 13)和Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Ala-Ala-Ala-Pro-Gln-Thr(SEQ ID NO: 14)。据报道这些单链胰岛素具有胰岛素活性，但是与IGF-I受体也具有相当高的亲和性。本专利技术的目的是提供与已知化合物相比具有改良性质的单链胰岛素，涉及到胰岛素的活性、物理稳定性和溶解性以及药代动力学例如延长或者迅速 作用特征。本专利技术的另一个目的是提供单链胰岛素的制备方法以及含有这些化合物的药物组合物。专利技术概述本专利技术一方面涉及了具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素或者其类似物或衍生物的B和A链的单链胰岛素，其中的连接肽具有5-11个氨基酸残基并且不含有两个相邻的碱性氨基酸残基并且其中单链胰岛素对人胰岛素受体的亲和性是人胰岛素的至少大约20% (如果单链胰岛素分子没有被酰化化学修饰的话)。在另一个方面中，本专利技术涉及具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素或者其类似物或衍生物的B和A链的单链胰岛素，其中的连接肽具有5-11个氨基酸残基，前提是如果连接肽含有两个相邻的碱性氨基酸残基则B和/或A链中的至少一个天然氨基酸残基被另一个可编码的氨基酸残基替代，或者A链、B链或者连接肽中的至少一个赖氨酸残基已经被酰化化学修饰，或者连接肽不是以下的序列 Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO 1),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO 5),Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO 6),Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO :8)，Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :9),或Arg-Arg-His_Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :10)。在另一个方面中本专利技术涉及具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素或者其类似物或衍生物的B和A链的单链胰岛素，其中的连接肽具有5-11个氨基酸残基，前提是Pl在大约6. 5以上的该单链胰岛素与人胰岛素的A和B本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素B和A链或者其类似物或衍生物的单链胰岛素，其中的连接肽具有5？11个氨基酸残基并且不含有两个相邻的碱性氨基酸残基，并且如果单链胰岛素分子没有被酰化化学修饰则其中单链胰岛素对人胰岛素受体的亲和性是人胰岛素对人胰岛素受体的亲和性的至少大约20％。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：T·B·克耶尔德森，A·S·安德森，M·施雷恩，A·R·索伦森，P·马德森，
申请(专利权)人：诺和诺德公司，
类型：发明
国别省市：