一种抗CD33单链抗体及光敏剂复合物及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种抗CD33单链抗体及光敏剂复合物及其制备方法，属于光动力治疗技术领域。本发明专利技术提供的编码抗CD33单链抗体的基因序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术提供的光敏剂复合物，由所述单链抗体、Ce6和亲水性修饰的C60连接而成。本发明专利技术提供的光敏剂复合物具有良好的靶向性，可以靶向地杀伤肿瘤细胞，对正常细胞没有破环；同时，光敏剂复合物的杀伤效果优于单独的光敏剂Ce6。

【技术实现步骤摘要】
一种抗CD33单链抗体及光敏剂复合物及其制备方法
本专利技术属于光动力治疗
，尤其涉及一种抗CD33单链抗体及光敏剂复合物及其制备方法。
技术介绍
急性髓系白血病(AML)是血液系统最常见的恶性肿瘤。CD33是白血病干细胞的主要标志物，主要表达在髓系祖细胞上，而在正常造血干细胞、成熟的粒细胞和其他组织细胞表面都不表达。研究发现，CD33在95％以上的AML患者中都有表达，因此CD33成为AML治疗的良好靶点。美罗他格(gemtuzumabozogamicin，GO)是人源化抗CD33单克隆抗体，于2001年被美国FDA批准，用于治疗老年复发性AML。目前，全球多家单位将GO与其它治疗方式(如：化疗、放疗、光热疗法)联合，对AML患者进行综合性治疗。但传统治疗中的化疗、放疗的毒副作用大；靶向CD33的抗体虽然针对性好，但疗效较为温和。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗CD33单链抗体及光敏剂复合物及其制备方法。本专利技术提供的光敏剂复合物具有良好的靶向性，可以靶向地杀伤肿瘤细胞，对正常细胞没有破环，毒副作用小，在急性淋巴性白血病的单独用药以及联合用药方面，有很广阔的前景。本专利技术提供了编码抗CD33单链抗体的基因，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供了一种抗CD33单链抗体，编码所述抗体的基因序列如SEQIDNO:1所示本专利技术还提供了一种抗CD33单链抗体表达载体，所述抗CD33单链抗体表达载体为融合有权利要求1所述基因的pE-SUMO载体。本专利技术还提供了一种光敏剂复合物，所述复合物由权利要求1所述单链抗体、Ce6和PEG修饰的C60连接而成；经PEG修饰修饰后的C60与Ce6通过非共价键相连；连接产物上的Ce6与单链抗体通过酰胺键相连。优选的是，所述PEG的Mw分子量为3000。优选的是，所述光敏剂复合物的粒径分布在30～105nm，所述光敏剂复合物的平均粒径为48.96nm。本专利技术还提供了上述技术方案所述光敏剂复合物的制备方法，包括以下步骤：1)将C60与溴代丙二酸乙酯在甲苯中进行Bingle环加成反应，得到C60丙二酸乙酯衍生物；将所述C60丙二酸乙酯衍生物水解，得到C60-COOH衍生物；2)将PEG两端的羟基分别进行氨基化修饰和甲氧醚修饰，得到H2N-PEG-OMe；3)将所述C60-COOH衍生物与H2N-PEG-OMe混合，搅拌过夜，酯化反应得到偶联产物C60-PEG；4)将所述偶联产物C60-PEG与Ce6混合，超声振荡，得到C60-PEG-Ce6；5)用EDC-HCl和NHS活化所述C60-PEG-Ce6中Ce6表面的羧基，将所述活化后的产物与GOscFv进行酯化反应得到光敏剂复合物；所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序限制。优选的是，所述步骤1)中水解的温度为80℃；所述步骤1)的环加成反应和水解反应中独立地加入NaH。优选的是，所述步骤4)中的超声振荡在乙醇水溶液中进行；所述乙醇水溶液的质量浓度为50％。优选的是，所述步骤5)的酯化反应在NaHCO3溶液中进行；所述C60-PEG-Ce6与GOscFv的摩尔比为1：10。本专利技术提供了一种抗CD33单链抗体。本专利技术提供的抗CD33单链抗体制成的光敏剂复合物具有良好的靶向性，单链抗体编码基因的设计能很好的将光敏剂复合物带到表达CD33分子的急性淋巴性白血病细胞表面，靶向地杀伤肿瘤细胞，对正常细胞没有破环；同时，光敏剂复合物的杀伤效果优于单独的光敏剂Ce6。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的菌落PCR验证GOscFv阳性重组菌结果图；图2为本专利技术实施例1提供的SDS-PAGE验证重组菌能否表达GOscFv-SUMO蛋白结果图；其中M：Marker；Lane1：未诱导的对照组，Lane2：加IPTG诱导组；图3为本专利技术实施例1提供的GOscFv-SUMO的WesternBlot验证结果图；图3a为用抗His抗体验证结果图，图3b为用抗SUMO抗体验证结果图；其中，Lane1：未诱导的对照组，Lane2：加IPTG诱导组；图4为本专利技术实施例1提供的SUMO酶解前后经Ni柱纯化的GOscFv-SUMO蛋白SDS-PAGE电泳结果图；其中，Lane1：GOscFv-SUMO蛋白；Lane2：GOscFv蛋白；图5为本专利技术实施例1提供的光敏剂复合物C60-PEG-Ce6-GOscFv合成流程示意图；图6为本专利技术实施例1提供的光敏剂复合物C60-PEG-Ce6-GOscFv的TEM分析图；图7为本专利技术实施例2提供的光敏剂复合物C60-PEG-Ce6-GOscFv粒径分析图；图8为本专利技术实施例2提供的MTT法检测光敏剂复合物C60-PEG-Ce6-GOscFv对AML细胞的PDT效应结果图；图9为本专利技术实施例2提供的MTT法检测光敏剂复合物C60-PEG-Ce6-GOscFv对正常PBMC细胞的PDT效应结果图；图10为本专利技术实施例3提供的光敏剂复合物C60-PEG-Ce6-GOscFv在AML模型中的PDT疗效结果图；图11为本专利技术实施例3提供的光敏剂复合物C60-PEG-Ce6-GOscFv在AML模型中PDT疗效的量化结果图。具体实施方式本专利技术提供了编码抗CD33单链抗体的基因，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。在本专利技术中，所述抗CD33单链抗体基因的设计原理为：通过drugbank得到美罗他格(GO)的编号：DB00056，查找得到其重链和轻链可变区的氨基酸，通过进行大肠杆菌密码子优化，得到对应的核酸序列GO-VL(SEQIDNO：2)、GO-VH(SEQIDNO：3)；通过(G4S)3Linker将上述两段核酸序列连接，得到抗CD33单链抗体(GOscFv)的基因序列：VL-Linker-VH，在VL-Linker-VH的5’端和3’端分别添加BamHI和HinderIII酶切位点，得到如SEQIDNO：1所示序列的单链抗体的编码序列(GOscFv)。在本专利技术中，所述单链抗体(GOscFv)分子量为上市的全长抗体的1/6，在降低分子量的同时，保留了对CD33抗原的靶向性。本专利技术对所述大肠杆菌密码子优化的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的密码子优化方法即可，如采用DNAMAN软件进行优化。本专利技术还提供了一种抗CD33单链抗体，编码所述抗体的基因序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供了一种抗CD33单链抗体表达载体，所述抗CD33单链抗体表达载体为融合有权利要求1所述基因的pE-SUMO载体。在本专利技术中，所述单链抗体的制备方法包括以下步骤：构建含有上述技术方案所述基因序列的pE-SUMO载体，通过大肠杆菌表达系统进行表达，将表达产物进行纯化；将所述纯化的产物采用SUMO蛋白酶进行酶解，得到抗CD33单链抗体。本专利技术对所述载体的构建方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的酶切连接构建法构建表达载体即可。所述表达载体优选为pE-SUMO。本专利技术对所述大肠杆菌表达系统的构建也没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的大肠杆菌表达系统进行构建即可。本专利技术对单链抗体的表达条件没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的蛋白表达方法即可。在本专利技术中，所述纯化方法优选为Ni柱纯化。本专利技术得到纯化产物后，本专利技术优选加入S本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码抗CD33单链抗体的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.编码抗CD33单链抗体的基因，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种抗CD33单链抗体，编码所述抗体的基因序列如SEQIDNO:1所示。3.一种抗CD33单链抗体表达载体，所述抗CD33单链抗体表达载体为融合有权利要求1所述基因的pE-SUMO载体。4.一种光敏剂复合物，其特征在于，所述复合物由权利要求1所述单链抗体、Ce6和PEG修饰的C60连接而成；经PEG修饰修饰后的C60与Ce6通过非共价键相连；连接产物上的Ce6与单链抗体通过酰胺键相连。5.根据权利要求4所述的光敏剂复合物，其特征在于，所述PEG的Mw分子量为3000。6.根据权利要求4或5所述的光敏剂复合物，其特征在于，所述光敏剂复合物的粒径分布在30～105nm，所述光敏剂复合物的平均粒径为48.96nm。7.一种权利要求4～6任意一项所述光敏剂复合物的制备方法，包括以下步骤：1)将C60与溴代丙二酸乙酯在甲苯中进行Bingle环加成反应，得到C60丙二酸乙酯衍生物；将所述C60丙二酸乙酯衍生物水解，得到C...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵磊，李斯文，
申请(专利权)人：李斯文，赵磊，
类型：发明
国别省市：江苏,32