一种不对称二甲基精氨酸免疫法测定试剂及检测方法技术

本发明专利技术是一种均相酶测定技术的免疫学检测的方法极其试剂，用于测定样品中不对称二甲基精氨酸（NG,NG,dimethyl‑L‑arginine,asymmetric dimethylarginine，ADMA）的含量。该方法采用抗ADMA特异性抗体、酶‑ADMA复合物，利用酶‑ADMA复合物与抗ADMA特异性抗体免疫学反应，形成抗原抗体复合物后，酶‑ADMA复合物活性受到抑制,通过测定反应体系中酶活性的变化,从而得到结合的酶标记物数量，从而得到待测样品中ADMA的含量。该方法的优点是可以像普通生物化学酶方法一样，实现免疫学测定，从而在全自动生化分析仪上同时测定多个样品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到小分子与蛋白质定向连接、小分子成分和检测方法，属于医学免疫体外诊断领域。是基于均相的免疫学酶法测定。尤其涉及一种检测方法和试剂盒的制备，特别是一种ADMA检测试剂及其制备和检测方法。
技术介绍
不对称二甲基精氨酸（NG,NG,dimethyl-L-arginine,asymmetricdimethylarginine，ADMA）也叫非对称二甲基精氨酸。1970年Kakimoto首次从人类尿液中分离出不对称二甲基精氨酸。ADMA由含有精氨酸残基的蛋白质在蛋白质精氨酸甲基转移酶(proteinargininemethyltransferases,PRMT)的作用下甲基化，甲基化的蛋白水解后即可释放出ADMA。ADMA能竞争性抑制一氧化氮合酶（NOS）使一氧化氮（NO）生成减少，在体内起内源性NO合成抑制剂的作用，造成血管内皮功能发生紊乱，进而导致动脉粥样硬化等一系列的心脑血管疾病的发生发展。ADMA与脑梗死及其危险因素有显著相关性，其对缺血性脑血管病的发生率和死亡率有着强大的预测能力。血浆ADMA水平在心血管疾病出现临床表现之前就已经开始升高。因此，ADMA作为一种前瞻性，独立的心血管病诊断指标具有重大意义。同时ADMA水平的升高不仅能作为心脑血管疾病的先兆，还能作为心衰，高血压，冠心病，糖尿病，肾衰肝脏衰竭，勃起功能障碍等疾病的一个重要危险因子。因此，ADMA作为一种新型的内皮功能不全和心血管疾病标志物在临床诊断方面具有重要意义。目前，定量测定ADMA的方法，有高效液相色谱法（HPLC），液质联用法（HPLC-MS），酶联免疫吸附法（ELISA）、化学发光免疫分析法（CLIA）。均存在操作复杂，检测时间长，自动化程度低，重复性较差，不利于仪器自动化和标准化。也有报道，ADMA酶法检测，所需反应都在3步或以上，所需酶的种类也在3种以上，且有的关键酶如瓜氨酸水解酶未见公开文献报道，来源途径不明，不易获得。增加了不确定性和不稳定性，不容易实现仪器的自动化和标准化。抗ADMA抗体的制备难度较高，存在特异性不好的缺点。与对称二甲基精氨酸，甲基精氨酸以及L-精氨酸等存在较大的交叉反应，特异性差，制备的试剂特异性差。有文献报道类似ADMA这种小分子的半抗原制备方法决定了制备的抗体的特异性和亲和力。小分子同载体蛋白的连接位点决定了制备抗体的特异性，要保证小分子的特异性抗原决定簇不在半抗原偶联过程中被破坏。载体蛋白同半抗原合适的连接臂长度能够保证小分子的充分暴露，如果过长，会大大降低小分子的免疫原性，太短，载体蛋白会影响小分子的结构。本专利技术采用特异性的连接臂，通过连接位点的定向选择，羧基位点或者氨基位点，充分暴露ADMA的免疫位点，从而获得高亲和力及高特异性的抗体。本专利技术还采用特异性的连接载体兔白蛋白、人白蛋白和鼠白蛋白，而不采用通用的连接载体如牛血清白蛋白，血蓝蛋白和甲状腺球蛋白等，主要是因为与牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白等耦联的ADMA刺激产生的抗血清也含有针对牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白等的抗体，可能导致假阳性结果；而血蓝蛋白的分子量较大，偶联得到的半抗原容易影响甚至屏蔽小分子的抗原表位，造成制备的抗体亲和力低。而使用兔血清白蛋白做载体免疫的兔子不太可能产生针对兔子自身的蛋白的抗体，采用鼠血清蛋白载体筛选得到的鼠抗人ADMA特异性单克隆抗体，亲和力和特异性更优于其他载体。目前市场上缺乏灵敏度高、特异性强的不对称二甲基精氨酸检测试剂，尤其是适合自动化检验的试剂。本专利技术采用酶偶联不对称二甲基精氨酸复合物，与不对称二甲基精氨酸特异性抗体免疫学反应，形成抗原抗体复合物后，酶-ADMA复合物的活性就受到抑制。样品中的ADMA与酶-ADMA复合物竞争性结合抗ADMA特异性抗体。样品中的ADMA越多，结合的抗体就越多。酶-ADMA复合物结合的抗体就越少，通过测定反应体系中酶活性的变化,可以得到样品中ADMA的含量。检测速度快、操作简单、灵敏度高、特异性强且可以在全自动生化分析仪上实现对小分子物质的高通量快速化检测的优点，具有较高的应用价值。
技术实现思路
本检测方法基于免疫学反应，采用均相免疫的酶学测定方法，将小分子ADMA与酶通过蛋白质连接技术形成复合物，与样品中的待测ADMA与抗ADMA特异性抗体竞争结合，通过酶活性的高低来实现样品中ADMA浓度的检测。该方法可以提供一种既安全又可快速、高效、灵敏、准确检测出待测样本中ADMA含量的均相酶免疫检测试剂及其制备方法。该试剂可应用于临床中广泛使用的各种类型的自动生化分析仪，从而达到大规模样品的测定要求，提高了实用性。本专利技术提供了检测ADMA的试剂盒，包含试剂R1，试剂R2，缓冲液，稳定剂，ADMA参考标准品的液体试剂盒或包含试剂R1，试剂R2，ADMA参考标准品的干粉试剂盒。进一步的，一个优选的技术方案是：一种ADMA均相免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗ADMA特异性抗体、用于检测抗ADMA特异性抗体-ADMA复合物的检测试剂制备及检测方法;上述ADMA均相免疫检测试剂盒基于以下原理：含有ADMA的生物样品同ADMA-G6PDH酶复合物竞争结合抗ADMA特异性抗体；ADMA-G6PDH酶复合物与抗ADMA特异性抗体形成免疫结合物后，其催化底物葡萄糖-6-磷酸的活性降低或丧失，反应产物NADH的量也降低；测定样品中ADMA的浓度量越高，竞争到的抗ADMA特异性抗体越多，抗ADMA特异性抗体对ADMA-G6PDH酶复合物的活性抑制越低，则反应生成的NADH量越多；根据测定NADH的量计算，从而得到样品中的ADMA含量。根据这一专利技术目的，进一步的一个优选实施方案：其中制备ADMA免疫原用于制备抗ADMA特异性抗体。优选的利用ADMA的羧基基团同载体蛋白交联，优选的连接基团氨基己酸；载体蛋白优选兔白蛋白和小鼠白蛋白；免疫动物优选新西兰大白兔和Balb/c小鼠；化学偶联方式优选碳二亚胺法；上述优选方法制备的抗ADMA特异性抗体对ADMA亲和力高，特异性好，同对称二甲基精氨酸、单甲基精氨酸、L-精氨酸均无交叉反应。根据这一专利技术目的的一个优选实施方案，其中制备ADMA-酶复合物用于测定ADMA测定试剂盒。优选的酶为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（EC1.1.1.49）；优选的采用ADMA氨基基团同葡萄糖-6-磷酸脱氢酶交联，连接基团为氨基己酸；ADMA与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的交联方法优选戊二醛法；ADMA与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶交联的酶活保护剂优选葡萄糖-6-磷酸NADH；上述保护剂葡萄糖-6-磷酸优选浓度10-100mM，NADH优选浓度为10-100mM；采用合理的酶保护剂，优先占据G6PDH的酶活性中心，避免ADMA-G6PDH偶联过程中酶活中心的破坏而导致的酶活丧失。根据这一专利技术目的的一个优选实施方案，其中ADMA测定试剂盒中R1试剂缓冲液优选甘氨酸缓冲液；PH优选4.0-8.0；葡萄糖-6-磷酸浓度优选10-100mM；NaCl浓度优选10-200mM；NAD+浓度优选10-100mM；0.001%-0.01%叠氮钠；吐温-20浓度优选的为0.01%-0.1%；BSA优选的为0.1%-0.5%；抗ADMA抗体优选的为0.01-2%。根据这一专利技术目的的一个优选实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定样品中ADMA的方法，由试剂R1、试剂R2和ADMA参考标准品的组成，其特征在于，（a）试剂R1中含有抗ADMA特异性抗体、缓冲剂、酶反应底物、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；（b）试剂R2含有酶‑不对称二甲基精氨酸复合物、缓冲剂、酶反应底物、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；（c）当试剂R1和R2反应时，样品中的ADMA与酶‑ADMA复合物竞争性结合抗ADMA特异性抗体，样品中的ADMA越多，结合的抗体就越多，酶‑ADMA复合物结合的抗体就越少，通过测定反应体系中酶活性的变化,可以得到样品中ADMA的含量。

【技术特征摘要】
1.一种测定样品中ADMA的方法，由试剂R1、试剂R2和ADMA参考标准品的组成，其特征在于，（a）试剂R1中含有抗ADMA特异性抗体、缓冲剂、酶反应底物、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；（b）试剂R2含有酶-不对称二甲基精氨酸复合物、缓冲剂、酶反应底物、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；（c）当试剂R1和R2反应时，样品中的ADMA与酶-ADMA复合物竞争性结合抗ADMA特异性抗体，样品中的ADMA越多，结合的抗体就越多，酶-ADMA复合物结合的抗体就越少，通过测定反应体系中酶活性的变化,可以得到样品中ADMA的含量。2.根据权利要求1所述的抗ADMA特异性抗体由ADMA免疫原免疫动物得到，ADMA免疫原的结构式图2所示，载体为兔血清白蛋白、人血清白蛋白和鼠血清白蛋白，载体蛋白通过ADMA的羧基基团定向选择性地连接到ADMA，A1为连接臂，连接臂为甘氨酸、赖氨酸、氨基己酸，以及-(CH2)n-O-CH2-COO-等，n为1至15之间的任意整数（如图1A）；载体蛋白通过ADMA的氨基基团定向选择性地连接到ADMA；A2为连接臂，连接臂为甘氨酸、赖氨酸、氨基己酸，以及基团-(CH2)n-O-CH2-NH-，n为1至15之间的任意整数（如图1B）；免疫的动物包含但不限定为兔、小鼠、山羊、马、羊、鸡及驼。3.根据权利要求1所述的酶-ADMA复合物的制备，其特征在于，上述酶-ADMA复合物中的酶可以是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（EC1.1.1.49），苹果酸脱氢酶（EC1.1.1.37），溶菌酶（EC3.2.1.17），己糖激酶（EC2.7.1.1），β-D-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23），淀粉酶（EC3.2.1.2）；优选的为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH），上述G6PDH对特定底物具有高...

【专利技术属性】
技术研发人员：周建平，
申请(专利权)人：北京德奥平生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11