CTHRC1在肝硬化诊断和治疗中的应用制造技术

本发明专利技术在肝硬化/纤维化领域首次提出利用检测CTHRCl基因及其产物，实现早期检测以及治疗肝硬化/纤维化的效果。本发明专利技术通过免疫组化实验、体内实验以及体外实验发现CTHRC1基因：在人肝硬化组织中表达上调，其参与调节肝纤维化的进展；有加剧肝纤维化进展的作用，能够加速肝功能损伤；可以加速肝星状细胞的活化，促进星状细胞的运动和收缩。然而使用CTHRC1中和抗体，针对CTHRC1进行阻断后，可逆转CTHRC1的作用，在动物体内使用CTHRC1中和抗体后，可以很大程度上减缓肝纤维化病变的进展。综上可见，CTHRCl具有成为良好的生物标记的潜应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学特别是基因诊断和治疗领域，尤其是CTHRC1基因在肝硬化诊断和治疗中的应用。
技术介绍
肝硬化，其前期病变表现为肝纤维化，是十分常见的肝脏慢性疾病[1]。多数肝纤维化患者经过15到20年的时间后会转变为不可逆转的肝硬化，甚至会进一步发展为肝癌[2]。肝纤维化的的病理表现为肝脏内纤维结缔组织的过度沉积(如Collagen)，是纤维增生(Fibrogenesis)和纤维分解(Fibrolysis)不平衡的结果。在肝纤维化进程中，肝星状细胞的活化是肝纤维化的中心事件。不同于肝癌，肝硬化的早期诊断十分困难，目前没有明确的分子标志物，临床检测手段主要是采用肝穿刺活检来进行诊断，其次是根据肝脾肿大、腹腔积液以及肝硬化并发症(如上消化道出血、肝性脑病、肝肾综合症等)这些临床病理特征来进行诊断[3]。但已有的检测手段存在一定缺陷，活检对于病人来说有一定创伤，而以并发症为依据又很难诊断出早期肝硬化。因此，寻找简便易行且能够准确监测病情的分子标志物的意义重大。CTHRC1是一种分子量大约为26KDa的分泌性糖蛋白，最初发现于球囊扩张动脉损伤大鼠模型研究中[4]。CTHRC1参与了血管重构，并在胰腺癌组织中高表达[5]。此外，CTHRC1在乳腺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤以及结肠癌中呈高表达，并且促进上述肿瘤的侵袭迁移[6-8]。在血管平滑肌细胞中，CTHRC1抑制TGF-β通路，但是对内皮细胞的TGF-β通路没有抑制作用[9]。CTHRC1基因的启动子结合区域有Smad的结合位点，这提示了CTHRC1可以受到TGF-β的调节[8]。在胃癌的研究中发现，加TGF-β1处理后，胃癌细胞的CTHRC1表达水平逐渐上调，伴随着TGF-β下游Smad信号通路的活化[8]。CTHRC1可以通过与Wnt5a和ROR2相互作用来激活Wnt/PCP信号通路，抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而发挥调节细胞骨架重排和细胞运动的功能[10]。所以，CTHRC1对于TGF-β和Wnt信号通路具有非常重要的调节作用。我们通过免疫组化实验发现，CTHRC1基因在人肝硬化组织中表达上调，可能参与调节肝纤维化的进展。我们进一步通过体内实验证实CTHRC1具有加剧肝纤维化进展，加速肝功能损伤的作用。之后通过体外实验发现CTHRC1可以加速肝星状细胞的活化，促进星状细胞的运动和收缩，而使用CTHRC1中和抗体针对CTHRC1进行阻断后，可逆转CTHRC1的作用。在动物体内使用CTHRC1中和抗体后，可以很大程度上减缓肝纤维化病变的进展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供与CTHRC1基因或产物相关的肝硬化/纤维化检测和治疗药物以及方法。本专利技术的一方面在于提供一种CTHRC1核酸序列或蛋白作为在样品中检测肝硬化或肝纤维化的试剂中的应用，其中CTHRC1的核酸序列如SEQIDNO:1所示，CTHRC1蛋白如SEQIDNO:2所示。其中，前述试剂是用于识别CTHRC1蛋白抗原表位的抗体。或者，前述试剂也可是用于识别CTHRC1核酸序列的核酸探针。本专利技术的另一方面在于提供一种CTHRC1核酸序列或蛋白作为在制备预防或治疗肝硬化或肝纤维化的药物中的应用，其中CTHRC1的核酸序列如SEQIDNO:1所示，CTHRC1蛋白如SEQIDNO:2所示。其中，前述药物是用于识别CTHRC1蛋白抗原表位的抗体。或者，前述药物包括CTHRC1核酸序列的反义核酸。本专利技术的另一方面在于提供一种CTHRC1核酸序列或蛋白作为体外筛选和制备肝硬化或肝纤维化药物的药靶的应用，其中CTHRC1的核酸序列如SEQIDNO:1所示，CTHRC1蛋白如SEQIDNO:2所示。本专利技术的又一方面在于提供一种肝硬化或肝纤维化的试剂盒，该试剂盒中包括一容器，容器中含有CTHRC1抗体，即蛋白抗原表位的抗体。更进一步地，该容器中可包括CTHRC1抗体作为一抗以及HRP标记的山羊抗兔抗体作为二抗。或，该容器中含有CTHRC1特异性探针。术语：本专利技术文本中所述的CTHRC1，在不同的语境下可能对应CTHRC1蛋白或核酸序列。其中，CTHRC1蛋白可以采用各种常规的制备方法制备。如基因工程方法或者人工合成方法等。例如，可将CTHRC1核酸序列表达为蛋白而得。一旦获得了含有CTHRC1基因序列的重组表达质粒，就可将其转化到相应宿主中进行蛋白表达。本专利技术所述“CTHRC1蛋白”也包括如SEQIDNO:2所示蛋白的天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他己知分子生物学的技术获得。所述“CTHRC1蛋白”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如氨基酸、Y-氨基酸等)的类似物。其中，CTHRC1核酸序列可以采用各种常规的制备方法制备。本专利技术的CTHRC1核酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本专利技术的核酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。获得了CTHRC1基因序列后，就可以将CTHRC1序列插入适当的表达载体，以获得重组表达质粒。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQNO：1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性，均属于本专利技术保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。其中，CTHRC1的抗原表位(Epitope),又称为抗原决定簇(Antigenicdeterminant),是抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合。本专利技术中所述的CTHRC1的抗原表位的抗体，是指任何现有技术中已知的CTHRC1抗体，也包括任何通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备得到的抗体。CTHRC1抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的CTHRCl蛋白，还可以作为用于预防肝纤维化或肝硬化的特异性治疗剂。抗体可以通过ELISA、Western印迹分析,或者与检测基团偶联,通过化学发光、同位素示踪等方法来检测。CTHRC1核酸探针是指与扩增的标记序列接触。该探针优选连接到一种发色团，但可被放射标记；亦或者该探针连接到一种结合伴侣上，如抗体或生物素，或另一种携带可检测结构域的结合伴侣上。本专利技术有以下特点：本专利技术在肝硬化/纤维化领域首次提出利用CTHRCl基因及其产物的检测来达到早期检测以及治疗的效果。CTHRCl具有成为良好的生物标记的潜应用前景。附图说明本专利技术将参考附图进行进一步的解释，其中：图1a-b为免疫组化染色图以及CTHRC1在组织中的表达水平的统计图；图2为CCl4和TAA化学诱导模型小鼠中，小鼠肝纤维化程度的组织染色图；图3为分别经CTHRC1中和抗体处理和IgG处理的CCl本文档来自技高网...

【技术保护点】
CTHRC1核酸序列或蛋白作为在样品中检测肝硬化或肝纤维化的试剂中的应用，其中所述CTHRC1的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CTHRC1蛋白如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.CTHRC1核酸序列或蛋白作为在样品中检测肝硬化或肝纤维化的试剂中的应用，其中所述CTHRC1的核酸序列如SEQIDNO:1所示，所述CTHRC1蛋白如SEQIDNO:2所示。2.如权利要求1所述的应用，其中所述试剂是用于识别CTHRC1抗原表位的抗体。3.如权利要求1所述的应用，其中所述试剂是用于识别CTHRC1核酸序列的核酸探针。4.CTHRC1核酸序列或蛋白作为在制备预防或治疗肝硬化或肝纤维化的药物中的应用，其中所述CTHRC1的核酸序列如SEQIDNO:1所示，所述CTHRC1蛋白如SEQIDNO:2所示。5.如权利要求4所述的应用，其中所述药物包括用于识别CT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志刚，李军，王亚辉，马铭泽，
申请(专利权)人：上海市肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31