一种金‑上转换纳米粒子三聚体的制备方法及其应用，属于分析化学技术领域。本发明专利技术主要包括20nm粒径的金纳米粒子的合成、金纳米粒子上Mucin‑1适配体的修饰、上转换纳米粒子上AFP适配体的修饰、金纳米粒子上AFP和Mucin‑1适配体部分互补序列的修饰、金‑上转换纳米粒子三聚体的组装、荧光和拉曼检测；在外加AFP后，荧光会增强；而在外加Mucin‑1后，拉曼信号会减弱，从而建立荧光信号与AFP浓度、拉曼信号与Mucin‑1浓度的标准曲线。本发明专利技术提供了一种用金‑上转换纳米粒子三聚体对癌症标志物的多重超灵敏检测方法，与传统检测方法相比成本低，灵敏度高，方便快捷，具有很好的实际应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种金-上转换纳米粒子三聚体的制备方法及其应用，属于分析化学
技术介绍
甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP），是一种致癌糖蛋白，是诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物，具有确立诊断、早期诊断、鉴别诊断的作用。大量的临床发现，70%-95%的原发性肝癌患者的AFP升高。粘蛋白-1（Mucin-1）发生在许多腺癌，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和其它组织。粘蛋白也过度表达在肺疾病，如哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺病或囊性纤维化。Mucin-1正诊断标记为恶性肿瘤和其他疾病过程中，通常会过度或错误表达。传统检测癌症标志物的方法有：酶联免疫法、电化学和基于仪器的液质联用、高效液相色谱等。酶联免疫法检测肿瘤标志物时，因蛋白质容易热变性，所以很难检测蛋白类肿瘤标志物，另外酶联免疫法的灵敏度较低，而且耗力耗时；电化学对样品的基质要求较高，很难实施；而用仪器检测时成本很高，并且对操作人员的操作技能有很高的要求。所以，本专利技术提出了一种新型的、简便的、灵敏的检测方法，把纳米材料作为一种新型探针，进行AFP和Mucin-1的超灵敏检测。通过DNA杂交将20nm粒径的金纳米粒子和20nm粒径的上转换纳米粒子组装成三聚体结构。目标物AFP和其适配体部分互补序列修饰的上转换纳米粒子竞争结合，荧光信号增强；而目标物Mucin-1和其适配体部分互补序列修饰的金纳米粒子竞争结合，拉曼信号减弱。将荧光信号与目标物AFP的浓度建立标准曲线，拉曼信号与目标物Mucin-1的浓度建立标准曲线，以此来定量检测癌症标志物甲胎蛋白及粘蛋白-1。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种金-上转换纳米粒子三聚体的制备方法及其应用，其提供的新型的、简便的、灵敏的检测方法，把纳米材料作为一种新型探针，进行AFP和Mucin-1的超灵敏检测。本专利技术的技术方案，一种金-上转换纳米粒子三聚体的制备方法，具体包括金纳米粒子的合成，上转换纳米粒子的提供，金-上转换纳米粒子三聚体的组装及结构表征，荧光、拉曼信号测试，用金-上转换纳米粒子三聚体检测AFP和Mucin-1。具体步骤如下：（1）金纳米粒子的合成：进行20nm粒径金纳米粒子的合成；48.75mL超纯水在搅拌下加入1.25mL4g/L的氯金酸，使其沸腾，沸腾状态保持2-3min，加入1.2mL10mg/mL的柠檬酸钠水溶液，观察颜色变化，待颜色不变后冷却至室温，放入冰箱中待用：（2）上转换纳米粒子的提供：由北京万德高科技发展有限公司购买；（3）金-上转换纳米粒子三聚体的组装：取两管50mL步骤（1）制备的已浓缩好的10nM20nm粒径金纳米粒子，分别与巯基修饰的Mucin-1的适配体及互补序列进行偶联，金纳米粒子︰巯基修饰的Mucin-1的适配体/互补序列的摩尔比为1︰3；再将50mL上转换纳米粒子与巯基修饰的AFP的适配体偶联，其中上转换纳米粒子︰巯基修饰的AFP摩尔比为1︰5；三管试剂均在室温下过夜反应，13000r/min离心15min，弃上清，然后用50mL的TBE缓冲液分散沉淀，分别得到Au-Mucin-1适配体、Au-互补序列及UCNP-AFP适配体，待用；将50mLAu-Mucin-1适配体、50mLAu-互补序列和50mLUCNP-AFP适配体杂交反应12h，得到组装产物金-上转换纳米粒子三聚体Au-Au-UCNP；离心15min，弃上清，后用100mL的超纯水分散，进行TEM、荧光和拉曼表征。Mucin-1适配体：5’-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-SH-3’；互补序列：5’-GATCAACTGCACAGCACCACAGACC-SH-3’；AFP适配体：5’-SH-GGCAGGAAGACAAACAGGACCGGGTTGTGTGGGGTTTTAAGAGCGTCGCCTGTGTGTGGTCTGTGGTGCTGT-3’。金-上转换纳米粒子三聚体的应用，用于癌症标志物的多重超灵敏检测，具体采用金-上转换纳米粒子三聚体检测甲胎蛋白AFP和粘蛋白-1Mucin-1。（4）AFP的检测：取100mL的金-上转换纳米粒子三聚体Au-Au-UCNP，加入1mL不同浓度的甲胎蛋白（AFP），使其终浓度在0-100aM（具体为0、1、2、5、10、20、50、100aM），反应10min，进行荧光测试，绘制标准曲线。（5）Mucin-1的检测：取100mL的金-上转换纳米粒子三聚体Au-Au-UCNP，加入1mL不同浓度的粘蛋白-1（Mucin-1），使其终浓度在0-10fM（具体为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10fM），反应10min，进行拉曼测试，绘制标准曲线。（6）样品测试：从无锡市第二人民医院获取三名病人的血清样品，稀释后取1mL，加入100mLAu-Au-UCNP组装体，进行荧光和拉曼测试，根据标准曲线得出样品所含AFP及Mucin-1的浓度，并与标准浓度进行比较。本专利技术的有益效果：本专利技术基于荧光和拉曼作为检测信号，可以分别检测两种癌症标志物甲胎蛋白AFP及粘蛋白-1Mucin-1。与传统的检测手段相比，具有灵敏度高、检测限低、方便、快捷的优点，有非常好的应用前景。附图说明图1金-上转换纳米粒子三聚体Au-Au-UCNP组装结构的TEM图。图2不同浓度AFP下金-上转换纳米粒子三聚体的荧光信号。图3基于金-上转换纳米粒子三聚体组装结构进行AFP检测标准曲线。图4不同浓度Mucin-1下金-上转换纳米粒子三聚体的拉曼信号。图5基于金-上转换纳米粒子三聚体组装结构进行Mucin-1检测标准曲线。具体实施方式以下实施例中的上转换纳米粒子购自北京万德高科技发展有限公司。实施例1基于金-上转换纳米粒子三聚体的癌症标志物的多重超灵敏检测方法。（1）金纳米粒子的合成：将48.75mL超纯水在搅拌下加入1.25mL4g/L的氯金酸，使其沸腾，沸腾状态保持2-3min，加入1.2mL10mg/mL的柠檬酸钠水溶液，观察颜色变化，待颜色不变后冷却至室温，放入冰箱中待用。（2）上转换纳米粒子的提供：由北京万德高科技发展有限公司购买。（3）金-上转换纳米粒子三聚体的组装：取两管50mL已浓缩好的20nm粒径金纳米粒子，分别与巯基修饰的Mucin-1的适配体及互补序列进行偶联，偶联摩尔比为1︰3；再将50mL上转换纳米粒子与巯基修饰的AFP的适配体偶联，偶联摩尔比为1︰5，三管在室温下过夜反应，13000r/min离心15min，弃上清，然后用50mL的TBE缓冲液分散沉淀，待用；将50mLAu-Mucin-1适配体、50mLAu-互补序列、50mLUCNP-AFP适配体杂交反应12h，组装产物为金-上转换纳米粒子三聚体Au-Au-UCNP，离心15min，弃上清，后用100mL的超纯水分散，进行TEM、荧光和拉曼表征。（4）AFP的检测：取100mL的金-上转换纳米粒子三聚体，加入1mL不同浓度的AFP溶液，使其终浓度范围分别为0、1、2、5、10、20、50、100aM，反应10min，进行荧光测试。最低检测限达0.059aM。（4）Mucin-1的检测：取100mL的金-上转换纳米粒子三聚体，加入1mL不同浓度的Mucin-1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种金‑上转换纳米粒子三聚体的制备方法，其特征在于包括金纳米粒子的合成，上转换纳米粒子的提供，金‑上转换纳米粒子三聚体的组装及结构表征，具体步骤如下：（1）金纳米粒子的合成：进行20nm 粒径金纳米粒子的合成；48.75mL超纯水在搅拌下加入1.25mL 4g/L的氯金酸，使其沸腾，沸腾状态保持2‑3min，加入1.2mL 10mg/mL的柠檬酸钠水溶液，观察颜色变化，待颜色不变后冷却至室温，放入冰箱中待用；（2）上转换纳米粒子的提供：由北京万德高科技发展有限公司购买；（3）金‑上转换纳米粒子三聚体的组装：取两管50mL步骤（1）制备的已浓缩好的 10nM 20nm粒径金纳米粒子，分别与巯基修饰的Mucin‑1的适配体及互补序列进行偶联，金纳米粒子︰巯基修饰的Mucin‑1的适配体/互补序列的摩尔比为1︰3；再将50mL上转换纳米粒子与巯基修饰的AFP的适配体偶联，其中上转换纳米粒子︰巯基修饰的AFP摩尔比为1︰5；三管试剂均在室温下过夜反应，13000r/min 离心15min，弃上清，然后用50mL的TBE缓冲液分散沉淀，分别得到Au‑Mucin‑1适配体、Au‑互补序列及UCNP‑ AFP适配体，待用；将50mL Au‑Mucin‑1适配体、50mL Au‑互补序列和50mL UCNP‑ AFP适配体杂交反应12h，得到组装产物金‑上转换纳米粒子三聚体Au‑Au‑UCNP；离心15min，弃上清，后用100mL的超纯水分散，进行TEM、荧光和拉曼表征。...
【技术特征摘要】
1.一种金-上转换纳米粒子三聚体的制备方法，其特征在于包括金纳米粒子的合成，上转换纳米粒子的提供，金-上转换纳米粒子三聚体的组装及结构表征，具体步骤如下：（1）金纳米粒子的合成：进行20nm粒径金纳米粒子的合成；48.75mL超纯水在搅拌下加入1.25mL4g/L的氯金酸，使其沸腾，沸腾状态保持2-3min，加入1.2mL10mg/mL的柠檬酸钠水溶液，观察颜色变化，待颜色不变后冷却至室温，放入冰箱中待用；（2）上转换纳米粒子的提供：由北京万德高科技发展有限公司购买；（3）金-上转换纳米粒子三聚体的组装：取两管50mL步骤（1）制备的已浓缩好的10nM20nm粒径金纳米粒子，分别与巯基修饰的Mucin-1的适配体及互补序列进行偶联，金纳米粒子︰巯基修饰的Mucin-1的适配体/互补序列的摩尔比为1︰3；再将50mL上转换纳米粒子与巯基修饰的AFP的适配体偶联，其中上转换纳米粒子︰巯基修饰的AFP摩尔比为1︰5；三管试剂均在室温下过夜反应，13000r/min离心15min，弃上清，然后用50mL的TBE缓冲液分散沉淀，分别得到Au-Mucin-1适配体、Au-互补序列及UCNP-AFP适配体，待用；将50mLAu-Mucin-1适配体、50mLAu-互补序列和50mLUCNP-AFP适配体杂交反应12h，得到组装产物金-上转换纳米粒子三聚体Au-Au-UCNP；离心15min，弃上清，后用100mL的超纯水分散，进行TEM、荧光和拉曼表征。2.根据权利要求1所述金-上转换纳米粒子三聚体的制备方法，其特征在于：Mucin-1适配体：5’-GCAGTTG...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐丽广，瞿爱华，胥传来，匡华，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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