雌三醇均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法技术

本发明专利技术公开了雌三醇均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法，属于免疫检测试剂技术领域。本发明专利技术制备的雌三醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗雌三醇特异性抗体，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；由该抗体制备得到的雌三醇检测试剂，可以精确快速地确定尿液、血液等生物样品中的雌三醇含量。与市场上现有的检测试剂、检测方法、制备方法比较，本发明专利技术检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低雌三醇检测成本，有利于临床大规模推广使用。

Homogeneous enzyme immunoassay reagent for female three alcohol, preparation method and detection method

The invention discloses a homogeneous enzyme immunoassay reagent for female and three alcohols, a preparation method and a detection method thereof, belonging to the technical field of immunoassay reagents. Three female alcohol immune prepared by the invention, high immunity, anti female three alcohol specific antibody induced high titer, and no cross reaction with 62 kinds of common drugs; three female alcohol detection reagent by the antibody prepared, can quickly and accurately determine the female three alcohol content urine, blood and other biological samples. On the market and the existing detection methods, detection reagent, preparation method, the invention kit has the advantages of convenient operation, high sensitivity, strong specificity, accurate result, can effectively reduce the cost of three female alcohol detection, is conducive to promote the use of large-scale clinical.

【技术实现步骤摘要】
雌三醇均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法
本专利技术属于免疫检测试剂领域，具体涉及一种雌三醇均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法。
技术介绍
雌三醇（Estriol，E3），其结构式如式（Ⅲ）所示：式（Ⅲ）雌三醇（Estriol，E3）是重要的内源性雌性激素之一。人体内存在游离雌三醇和结合雌三醇，通常男性及未孕妇女体内的雌三醇含量低于2.2ng/mL，而妊娠期妇女体内的雌三醇含量一般高于31.6ng/mL。在妊娠期检查时，可以通过检测孕妇血清或尿液中E3的含量来判断胎儿的发育情况。正常孕龄女性体内雌三醇的主要来源是雌二醇和雌酮的代谢产物，因而在血清样品中的含量很低；孕妇体内雌三醇的主要来源是婴儿和胎盘，且含量一般较高(10ng/mL)。孕妇血清中游离态雌三醇含量为临床上指示胎盘功能的重要参数。通过检测孕妇血清或尿液中雌三醇的含量，可以判断胎儿的发育状况。因此，快速、准确地检测血清或尿液中雌三醇的含量对于科学研究和临床诊断都具有重要意义。目前，检测游离雌三醇或总雌三醇的常用方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、酶联免疫分析法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)和化学发光免疫分析法(CLIA)等，但是这些方法在临床大规模推广应用方面均具有一定的局限性。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的雌三醇检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。因此，研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的雌三醇测定试剂盒已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对雌三醇的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，能有效满足国内日益增长的临床检测需求。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术存在的缺陷，采用独特的雌三醇制备免疫原性强的雌三醇免疫原及其抗体，用该抗体制备的雌三醇均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对雌三醇高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低雌三醇检测成本，有利于临床推广使用。本专利技术的一个目的在于提供一种雌三醇均相酶免疫检测试剂，含有抗雌三醇特异性抗体和指示试剂，所述的指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或发光试剂中的一种，优选为酶试剂；所述的酶试剂由雌三醇酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；所述的抗雌三醇特异性抗体由雌三醇免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与雌三醇特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；所述的雌三醇免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：式（Ⅰ）载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽。优选为血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋白，更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。所述的雌三醇免疫原由雌三醇衍生物与上述载体连接而成，雌三醇衍生物的化学结构如式（Ⅱ）所示：式（Ⅱ）。所述的雌三醇免疫原的制备步骤如下：（1）将载体蛋白100～300g溶解于25～75mL0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；（2）将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100～300mg雌三醇衍生物、1.75～5.25mL二甲基甲酰胺、1.75～5.25mL乙醇、3.5～10.5mL10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、100～300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，将上述化学品在室温下搅拌溶解反应30～60min；（3）将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到雌三醇免疫原。一种抗雌三醇特异性抗体，由上述的雌三醇免疫原免疫实验动物后生产得到。所述的抗雌三醇特异性抗体由上述制得的雌三醇免疫原采用常规方法接种实验动物，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：（1）用PBS将上述合成的BSA-雌三醇免疫原稀释至0.1～3.0mg/mL，得到抗原溶液，然后用0.5～5.0mL抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；（2）2～3周后，再用0.5～5.0mL相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3～6次；（3）对上述实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000～1:50000的抗雌三醇特异性抗体。本专利技术的抗雌三醇特异性抗体为完整的抗体分子，也包括保留与雌三醇特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。本专利技术的抗体为采用单一的雌三醇免疫原对实验动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种，优选为兔。本专利技术的另一个目的在于提供雌三醇均相酶免疫检测试剂的制备方法。雌三醇均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：（1）试剂A：将2.018～8.072g、5.625～22.50mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856～3.422g、5.625～22.50mM葡萄糖-6-磷酸用0.5～2L55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将抗雌三醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗雌三醇特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:200～1:7500，优选为1:1200；（2）试剂B：将雌三醇酶标偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中，雌三醇酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:200～1:7500，优选为1:2500；其中，雌三醇酶标偶联物的制备方法包含以下步骤：（1）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取7.5～22.5mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温溶解于6～18mL含有72.6mg0.05MTris、8mg3.3mMMgCl2和100mgNaCl的溶液中，pH=8.5～9.0；在溶液中加入112.5～337.5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、67.5～202.5mg葡萄糖-6-磷酸以及0.375～1.125mL卡必醇；加热到30-35摄氏度，再一次性加入1～3mL二甲基亚砜，摇匀后静置5-15s；（2）雌三醇衍生物的激活：在无水状态下称取5～15mg雌三醇衍生物，溶解于300～900µL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-10~-14℃；加入1.5～4.5µL三丁胺；加入0.75～2.25µL氯甲酸异丁酯；加入0.1～2µL碳二亚胺（EDC）；5～15mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺；-10~-14℃搅拌30～60分钟；（3）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与雌三醇衍生物的连接：将步骤（2）激活的温度为-10~-14℃的雌三醇衍生物溶液逐滴加入到步骤（1）溶解的温度为30-35摄氏度的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8℃搅拌过夜；（4）纯化产物：通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。所述的雌三醇衍生物结构式如式（Ⅱ）所示：式（Ⅱ）。本专利技术的又一个目的在于提供雌三醇含量的检测方法。雌三醇含量的检测方法，采用前述的制备方法制备得到雌三醇均相酶免疫检测试剂并用于雌三醇含量的检测，包括如下步骤：1）将待测样本与抗雌三醇特异性抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种雌三醇均相酶免疫检测试剂，其特征在于：含有抗雌三醇特异性抗体和指示试剂，所述的指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或发光试剂中的一种，优选为酶试剂；所述的酶试剂由雌三醇酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶‑半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖‑6‑磷酸；所述的抗雌三醇特异性抗体由雌三醇免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与雌三醇特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；所述的雌三醇免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：

【技术特征摘要】
1.一种雌三醇均相酶免疫检测试剂，其特征在于：含有抗雌三醇特异性抗体和指示试剂，所述的指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或发光试剂中的一种，优选为酶试剂；所述的酶试剂由雌三醇酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；所述的抗雌三醇特异性抗体由雌三醇免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与雌三醇特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；所述的雌三醇免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：式（Ⅰ）载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽。2.根据权利要求1所述的一种雌三醇均相酶免疫检测试剂，其特征在于：所述的完整的抗体分子、抗体片段或抗体衍生物，为采用单一的雌三醇免疫原对实验动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种。3.一种如权利要求1所述的雌三醇均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：（1）试剂A：将2.018～8.072g、5.625～22.50mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856～3.422g、5.625～22.50mM葡萄糖-6-磷酸用0.5～2L55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将抗雌三醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗雌三醇特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:200～1:7500；（2）试剂B：将雌三醇酶标偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中，雌三醇酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:200～1:7500；其中，雌三醇酶标偶联物的制备方法包含以下步骤：（1）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取7.5～22.5mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温溶解于6～18mL含有72.6mg0.05MTris、8mg3.3mMMgCl2和100mgNaCl的溶液中，pH=8.5～9.0；在溶液中加入112.5～337.5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、67.5～202.5mg葡萄糖-6-磷酸以及0.375～1.125mL卡必醇；加热到30-35摄氏度，再一次性加入1～3mL二甲基亚砜，摇匀后静置5-15s；（2）雌三醇衍生物的激活：在无水状态下称取5～15mg雌三醇衍生物，溶解于300～900µL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-10~-14℃；加入1.5～4.5µL三丁胺；加入0.75～2.25µL氯甲酸异丁酯；加入0.1～2µL碳二亚胺EDC；5～15mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺；-10~-14℃搅拌30～60分钟；（3）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与雌...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱雪明，虞留明，
申请(专利权)人：苏州博源医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32