一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌诊断方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌诊断方法及试剂盒。本发明专利技术方法基于的免疫磁球为修饰有抗上皮粘附分子抗体的磁性纳米球。将免疫磁珠投入到穿刺标本中孵育5~10min，再通过磁分选、洗涤、涂片和染色等步骤即实现了对转移癌细胞的灵敏检测和可视化诊断。本发明专利技术方法捕获效率高、特异性好，对癌细胞形态影响小，总诊断准确率高达99.1%。本发明专利技术实现了对淋巴结反应性增生、恶性淋巴瘤和转移癌的区别诊断，磁分选后的细胞涂片可直接用于瑞氏染色、免疫细胞化学、免疫组织化学和原位荧光杂交等鉴定，这将成为转移癌诊断的有力手段，具有重要的医学意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于纳米材料及医学领域，具体涉及一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌诊断方法及试剂盒。
技术介绍
磁性、生物靶向功能纳米微球已经实现了对核酸、病毒、细菌、蛋白分子和肿瘤细胞的检测，并得到广泛报道和生物医学领域的应用。Xie等人(Fluorescent-magneticdual-encodednanospheres:apromisingtoolforfast-simultaneous-addressablehigh-throughputanalysis，Nanotechnology，2012，23(3)，第035602页)首次用层层组装法实现了微纳球的磁性、荧光和生物靶向三重编码。Wen等人(Quick-ResponseMagneticNanospheresforRapid,EfficientCaptureandSensitiveDetectionofCirculatingTumorCells，Acs.Nano.，2014，8(1),第941-949页)用简便的、高效可控的层层组装策略构建了一种磁性纳米微球，这种纳米尺寸的微球磁响应迅速，1min内可以被商品化的磁力架全部吸引，此外，磁性纳米微球还具备良好的单分散性，在血液中不会发生团聚和沉淀，以单分散态100％被回收。偶联了EpCAM抗体的磁球通过抗原抗体的作用成功的捕获了全血中极少的肿瘤细胞，孵育5min捕获率达到94％，磁分选后的肿瘤细胞仍保持较高的活性，可养活率为90.5％，可以用来再培养、RT-PCR、ICC鉴定等分析。将这种磁性纳米微球应用于癌症患者全血中CTCs的检测，成功的检测到了低至1个循环肿瘤细胞，显示了较高的灵敏度和良好的重现性。作为一种肿瘤细胞富集和检测工具，磁性纳米微球拥有广阔的应用前景。恶性肿瘤由于其侵袭和转移的特性严重威胁着人类的生命安全，而癌症早期恶性肿瘤细胞主要通过淋巴道转移，所以细针淋巴结穿刺(FNA)检查成为临床上区分反应性增生、恶性淋巴瘤或转移性癌的重要手段之一。因为FNA是一种微小的活检，因此也有人称它为ABC(aspirationbiopsycyology)，即针吸活检细胞学，不仅能观察单个细胞的形态，更能观察细胞团内细胞的排列和生长方式，它提供了远比脱落细胞学为多的信息。据此不仅能判断肿瘤性疾病，也能诊断非肿瘤性疾病；不仅能断定肿瘤的良、恶性，还能判断其组织学类型，为做出类似病例组织学的诊断提供了可能性。这也是目前FNA诊断的基本趋势。Zhang等人(颈部淋巴结细针穿刺细胞学检查的临床应用(Applicationoffine-needleaspitationcytologyincervicallymphnodes)，肿瘤防治杂志(ChinJCancerPrevTreat)，2005,12(23)，第1775-1778页)对931例颈部肿大淋巴结的细针穿刺诊断进行，回顾性分析发现FNA检查的敏感度仅为82.5％，其中对转移癌的诊断敏感度为92.6％，总准确率为95.7％。从这一结果看来针吸细胞学检查虽然是一种可靠、准确率较高的淋巴结病理诊断方法，但是仍然存在读片依赖医生主观判断、穿刺标本有限以及对不典型细胞难以区分诊断等因素造成假阴性率和假阳性率过高等问题亟待解决。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌细胞的收集方法。基于该收集方法，本专利技术的另一目的在于提供一种快速、准确诊断淋巴结转移癌的方法，以提高穿刺细胞学诊断淋巴结转移癌的准确率。本专利技术的目的还在于提供可以实现上述方法的试剂盒。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌细胞的收集方法，包括如下步骤：将免疫磁球(IMNs)加入到转移癌病人的淋巴结穿刺物中，20～37℃轻摇孵育5～10min，磁分选并用1×PBS洗涤获得癌细胞。所述的免疫磁球为修饰了抗上皮粘附分子(EpCAM)抗体的磁性纳米球；所述的磁性纳米球为表面组装了5层磁性纳米粒子的苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球，其粒径为429nm。一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌的诊断方法，包括如下步骤：将免疫磁球加入到含有转移癌病人淋巴结穿刺物的1×PBS溶液中，20～37℃轻摇孵育5～10min，磁分选并用1×PBS洗涤2次，然后将浊液分散于10μL1×PBS中，用移液枪滴加到粘附载玻片上疏水笔划定的区域内(1.5cm×1.5cm)，并均匀铺展开来，将细胞涂片置于钨灯下进行干片处理，然后用瑞氏染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察快速做出诊断。一种收集淋巴结转移癌细胞的试剂盒，包含上述免疫磁球、PBS和磁力架。该试剂盒的使用方法包括如下步骤：将转移癌病人的淋巴结穿刺物分散于1×PBS中，加入免疫磁球20～37℃轻摇孵育5～10min，然后用磁力架进行磁分选并用1×PBS缓冲溶液洗涤，获得癌细胞。一种淋巴结转移癌的诊断试剂盒，包含上述免疫磁球、PBS、磁力架、粘附载玻片、瑞氏染色试剂。上述试剂盒的使用方法包括如下步骤：将转移癌病人的淋巴结穿刺物分散于1mL1×PBS中，加入免疫磁球20～37℃轻摇孵育5～10min，然后用磁力架进行磁分选并用1×PBS洗涤，最后分散于10μL1×PBS中，用移液枪滴加到载玻片疏水笔划定的区域内(1.5cm×1.5cm)，并均匀铺展开来，将细胞涂片置于钨灯下进行干片处理，然后用瑞氏染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察。上述试剂盒还包含离心管、移液枪等。本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术方法通过免疫磁分选的方法可实现特异性捕获穿刺物中的转移癌细胞(上皮来源)，无需进行磁球释放，涂在玻片上便于后续的一系列观察和鉴定，包括瑞氏染色观察癌细胞形态、免疫细胞化学鉴定、免疫组织化学鉴定以及荧光原位杂交技术的分子水平鉴定。(2)本专利技术方法可实现极少量淋巴结穿刺物中稀少癌细胞的检测，操作简便、省时，对标本的损失较少，灵敏度高。诊断结果一目了然，便于观察。(3)本专利技术方法解决了仅从细胞形态上难以区别诊断反应性增生、恶性淋巴瘤和转移性癌的问题，提高了诊断的敏感度、特异度和诊断准确度。且磁分选过程对癌细胞形态和细胞环境影响较小，仍能保留其病理学特征判据。附图说明图1为免疫磁球(IMNs)用于淋巴结穿刺物中癌细胞的检测示意图，其涂片可进行瑞氏染色、细胞免疫化学(ICC)、免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)等鉴定。图2为磁性纳米球的表征结果。其中，(a)为磁性纳米球的透射电镜(TEM)图；(b)为磁力架在不同吸引时间下对磁性纳米球的捕获效率；(c)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌细胞的收集方法，其特征在于包括如下步骤：将免疫磁球加入到转移癌病人的淋巴结穿刺物中，20～37℃孵育5～10min，磁分选并用1×PBS洗涤获得癌细胞；所述的免疫磁球为修饰了抗上皮粘附分子抗体的磁性纳米球；所述的磁性纳米球为表面组装了5层磁性纳米粒子的苯乙烯‑丙烯酰胺共聚纳米球，其粒径为429nm。

【技术特征摘要】
1.一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌细胞的收集方法，其特征在于包括如下步骤：将免
疫磁球加入到转移癌病人的淋巴结穿刺物中，20～37℃孵育5～10min，磁分选并用1×PBS洗
涤获得癌细胞；
所述的免疫磁球为修饰了抗上皮粘附分子抗体的磁性纳米球；
所述的磁性纳米球为表面组装了5层磁性纳米粒子的苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球，其粒
径为429nm。
2.一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌的诊断方法，其特征在于包括如下步骤：将免疫磁
球加入到含有转移癌病人淋巴结穿刺物的1×PBS溶液中，20～37℃孵育5～10min，磁分选并
用1×PBS洗涤2次，然后将浊液分散于10μL1×PBS中，用移液枪滴加到粘附载玻片上疏水
笔划定的区域内，并均匀铺展开来，将细胞涂片置于钨灯下进行干片处理，然后用瑞氏染色
试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察做出诊断。
3.一种收集淋巴结转移癌...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦银辉，庞代文，张志凌，吴玲玲，夏和顺，漆楚波，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42