一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方法。该方法包括如下步骤：A)构建由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库；用于扩增抗体VH和VL的引物对均为同种属简并引物对，用于连接VH和VL的接头为同种属CH1；B)获得特异于所述靶标抗原的所述目标单链抗体的基因编码序列；靶标抗原和待检测单链抗体共表达，并用标签蛋白Flag标记抗原，借助荧光标记抗标签蛋白抗体通过流式细胞分选法筛选获得携带有目标单链抗体的重组细菌后，通过提取质粒重转宿主菌的方法拯救目标单链抗体。本发明专利技术在传统的细菌展示技术的基础上，做了改进和创新，根据抗体展示载体所必需的元件和基本原理构建了新的抗体细菌展示系统。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方法。
技术介绍
细菌展示技术又称以细胞内膜为基础的细胞间质表达技术(anchored periplasma expression technology，APEx)。该技术特点是利用细胞间质膜脂蛋白的信号肽NlpA leader将目的蛋白运送到细菌间质腔，而NlpA leader在蛋白质跨膜运输过程中被逐步降解，剩下的6个氨基酸(CDQSSS)与细胞内膜外侧的磷脂层形成脂苷键，从而将与其融合的抗体片段展示于细菌内膜外侧。当细菌外膜被溶菌酶消化后成原生质球，孵育液中的抗原可进入细菌间质与锚定在细胞内膜外侧的抗体片段结合，然后将其与荧光标记的抗体进行共孵育，阳性克隆可被流式细胞仪高通量的检测分离。pelB leader为果胶酶基因前导肽，可以引导与其融合的蛋白质进入细菌间质，并且在进入间质后也被降解完全。其融合的蛋白质在间质腔中和牟定的具有结合能力的抗体片段结合。细菌展示技术在筛选抗体方面具有很多优势如：(l)高富集比；(2)高阳性率；(3)由于反应在溶液状态下进行，可克服常规生物淘洗过程中由于筛选配基固定化而导致的“亲和效应”。应用流式细胞术(FCM)进行筛选可以真正的做到实时监测同步跟进，非常直观的追踪抗原表位的甄别情况。此外，该技术相对简便易行，只要经过相应的酶切位点就可以直接将抗体片段插入到展示载体中，并且经过细菌电转化可获得库容量高达109～1010的抗体库，满足了抗体筛选对库容量要求。全世界范围内，只有美国Texas大学于2007年在美国科学院院报上报道了展示Fab抗体库的展示技术APEx 2-hybrid，所利用的宿主菌为E.coli DH10B，但是迄今为止尚无文献验证该方法的可行性和实用性。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的编码基因的方法。本专利技术所提供的获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的编码基因的方法，具体可包括如下步骤：A)按照包括如下步骤的方法构建由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库：(a1)根据已知的抗体框架区序列，设计并合成用于扩增抗体重链可变区的简并引物对1，以及用于扩增抗体轻链可变区的简并引物对2；所述已知的抗体框架区序列为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的抗体框架区序列；如所述靶标抗原为能够感染人的乙肝病毒的某一蛋白，则所述已知的抗体框架区序列为人的抗体框架区序列；(a2)采用所述简并引物1和所述简并引物对2从初始样本中分别扩增得到抗体重链可变区集合和抗体轻链可变区集合；所述初始样本中含有由不同种抗所述靶标抗原的抗体组成的抗体库；所述初始样本可为如下a)或b)：a)健康个体的组织样本(如血液等)，所述健康个体为免疫了含有所述靶标抗原或其编码核酸的疫苗后，激起免疫反应产生相应抗体的健康个体；b)患病个体的组织样品(如血液等)，所述患病个体为因携带所述靶标抗原的致病微生物(如病毒、细菌或真菌等)感染所引起的患病个体，且经证实已激起免疫反应并产生抗体。所述抗体重链可变区集合为由不同重链可变区组成的集合；所述轻链可变区集合为由不同轻链可变区组成的集合；所述简并引物对1和所述简并引物对2均既可为一个引物对，也可为多个引物对。当为多个引物对时，采用所述简并引物对1中的每个引物对分别对所述初始样本进行扩增，扩增所得片段的集合即为所述抗体重链可变区集合；采用所述简并引物对2中的每个引物对分别对所述初始样本进行扩增，扩增所得片段的集合即为所述抗体轻链可变区集合。(a3)将所述抗体重链可变区集合中的不同重链可变区和所述抗体轻链可变区集合中的不同轻链可变区通过重链恒定区CH1进行随机连接，获得由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库；所述重链恒定区CH1为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的重链恒定区CH1的前15个氨基酸；如所述靶标抗原为能够感染人的乙肝病毒的某一蛋白，则所述重链恒定区CH1为人的重链恒定区CH1的前15个氨基酸；在本专利技术中，所述抗体重链可变区连接于所述重链恒定区CH1的上游；所述抗体轻链可变区连接于所述重链恒定区CH1的下游。B)按照包括如下步骤的方法获得特异于所述靶标抗原的所述目标单链抗体的基因编码序列：(b1)将所述基因编码库中的各待检测单链抗体编码基因分别与靶标抗原-标签蛋白融合基因共同构建于同一表达载体，并使所述待检测单链抗体编码基因融合于信号肽1的编码基因的下游，使所述靶标抗原-标签蛋白融合基因融合于信号肽2的编码基因的下游，获得重组表达载体库；所述重组表达载体库中各载体上均含有所述靶标抗原-标签蛋白融合基因和任一种所述待检测单链抗体编码基因；所述靶标抗原-标签蛋白融合基因为由所述靶标抗原的编码基因和所述标签蛋白的编码基因融合而成的融合基因；所述信号肽1为具有如下功能的信号肽：将与其融合的目的蛋白展示于细菌内膜外侧(即将所述与其融合的目的蛋白运送到细菌间质腔，并定位于细菌内膜外侧)；所述信号肽2为具有如下功能的信号肽：将与其融合的目的蛋白运送到细菌间质腔后自身完全降解，所述目的蛋白游离于所述细菌间质腔内；所述信号肽1不具有所述信号肽2的以上功能；且所述信号肽2也不具有所述信号肽1的以上功能。(b2)将所述重组表达载体库中的各重组表达载体转入宿主细菌，得到重组细菌库；所述重组细菌库中各重组细菌中均含有任一种所述重组表达载体(即在所述重组细菌库中，每个所述重组细菌中均只含有一种所述重组表达载体，这一种重组表达载体可为所述重组表达载体库中的任一种所述重组表达载体)；(b3)培养所述重组细菌库，诱导所述重组表达载体进行表达，由所述待检测单链抗体编码基因编码所得的待检测单链抗体被展示于所述细菌内膜外侧，由所述靶标抗原-标签蛋白融合基因编码所得的靶标抗原-标签融合蛋白游离于所述细菌间质腔内；(b4)去除所述重组细菌库中各重组细菌的外膜(如用溶菌酶处理)，得到原生质球库；所述原生质球库中每个原生质球上均展示有任一种所述待检测单链抗体，游离于所述原生质球外的所述靶标抗原-标签融合蛋白能够被所述待检测单链抗体中的特异性单链抗体所捕获，形成抗原抗体复合物(而所述原生质球表面的非特异性单链抗体则不能捕获所述靶标抗原)；(b5)将所述原生质球库与经荧光标记的抗所述标签蛋白的抗体共同孵育，只有表面形成了所述抗原抗体复合物的原生质球能够被标记上所述荧光，从所述原生质球库中获得表面被标记上了所述荧光的原生质球本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的编码基因的方法，包括如下步骤：A)按照包括如下步骤的方法构建由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库：(a1)根据已知的抗体框架区序列，设计并合成用于扩增抗体重链可变区的简并引物对1，以及用于扩增抗体轻链可变区的简并引物对2；所述已知的抗体框架区序列为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的抗体框架区序列；(a2)采用所述简并引物1和所述简并引物对2从初始样本中分别扩增得到抗体重链可变区集合和抗体轻链可变区集合；所述初始样本中含有由不同种抗所述靶标抗原的抗体组成的抗体库；所述抗体重链可变区集合为由不同重链可变区组成的集合；所述轻链可变区集合为由不同轻链可变区组成的集合；(a3)将所述抗体重链可变区集合中的不同重链可变区和所述抗体轻链可变区集合中的不同轻链可变区通过重链恒定区CH1进行随机连接，获得由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库；所述重链恒定区CH1为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的重链恒定区CH1的前15个氨基酸；B)按照包括如下步骤的方法获得特异于所述靶标抗原的所述目标单链抗体的基因编码序列：(b1)将所述基因编码库中的各待检测单链抗体编码基因分别与靶标抗原‑标签蛋白融合基因共同构建于同一表达载体，并使所述待检测单链抗体编码基因融合于信号肽1的编码基因的下游，使所述靶标抗原‑标签蛋白融合基因融合于信号肽2的编码基因的下游，获得重组表达载体库；所述重组表达载体库中各载体上均含有所述靶标抗原‑标签蛋白融合基因和任一种所述待检测单链抗体编码基因；所述靶标抗原‑标签蛋白融合基因为由所述靶标抗原的编码基因和所述标签蛋白的编码基因融合而成的融合基因；所述信号肽1为具有如下功能的信号肽：将与其融合的目的蛋白展示于细菌内膜外侧；所述信号肽2为具有如下功能的信号肽：将与其融合的目的蛋白运送到细菌间质腔后自身完全降解，所述目的蛋白游离于所述细菌间质腔内；(b2)将所述重组表达载体库中的各重组表达载体转入宿主细菌，得到重组细菌库；所述重组细菌库中各重组细菌中均含有任一种所述重组表达载体；(b3)培养所述重组细菌库，诱导所述重组表达载体进行表达，由所述待检测单链抗体编码基因编码所得的待检测单链抗体被展示于所述细菌内膜外侧，由所述靶标抗原‑标签蛋白融合基因编码所得的靶标抗原‑标签融合蛋白游离于所述细菌间质腔内；(b4)去除所述重组细菌库中各重组细菌的外膜，得到原生质球库；所述原生质球库中各原生质球上均展示有任一种所述待检测单链抗体，游离于所述原生质球外的所述靶标抗原‑标签融合蛋白能够被所述待检测单链抗体中的特异性单链抗体所捕获，形成抗原抗体复合物；(b5)将所述原生质球库与经荧光标记的抗所述标签蛋白的抗体共同孵育，只有表面形成了所述抗原抗体复合物的原生质球能够被标记上所述荧光，从所述原生质球库中获得表面被标记上了所述荧光的原生质球，记为荧光‑原生质球；所述荧光‑原生质球的表面展示的所述待检测单链抗体即为所述目标单链抗体；(b6)从所述荧光‑原生质球中提取质粒，再次转入所述宿主细菌，进行所述质粒的扩繁培养，从培养后的细菌中提取所述质粒，保种；对所述质粒测序后获得所述目标单链抗体的基因编码序列。...

【技术特征摘要】
1.一种获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的编码基因的方法，包括如下步骤：
A)按照包括如下步骤的方法构建由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编
码库：
(a1)根据已知的抗体框架区序列，设计并合成用于扩增抗体重链可变区的简并
引物对1，以及用于扩增抗体轻链可变区的简并引物对2；
所述已知的抗体框架区序列为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的抗体
框架区序列；
(a2)采用所述简并引物1和所述简并引物对2从初始样本中分别扩增得到抗体
重链可变区集合和抗体轻链可变区集合；
所述初始样本中含有由不同种抗所述靶标抗原的抗体组成的抗体库；
所述抗体重链可变区集合为由不同重链可变区组成的集合；所述轻链可变区集合
为由不同轻链可变区组成的集合；
(a3)将所述抗体重链可变区集合中的不同重链可变区和所述抗体轻链可变区集
合中的不同轻链可变区通过重链恒定区CH1进行随机连接，获得由不同待检测单链抗
体编码基因组成的基因编码库；
所述重链恒定区CH1为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的重链恒定区
CH1的前15个氨基酸；
B)按照包括如下步骤的方法获得特异于所述靶标抗原的所述目标单链抗体的基
因编码序列：
(b1)将所述基因编码库中的各待检测单链抗体编码基因分别与靶标抗原-标签蛋
白融合基因共同构建于同一表达载体，并使所述待检测单链抗体编码基因融合于信号
肽1的编码基因的下游，使所述靶标抗原-标签蛋白融合基因融合于信号肽2的编码基
因的下游，获得重组表达载体库；所述重组表达载体库中各载体上均含有所述靶标抗
原-标签蛋白融合基因和任一种所述待检测单链抗体编码基因；
所述靶标抗原-标签蛋白融合基因为由所述靶标抗原的编码基因和所述标签蛋白
的编码基因融合而成的融合基因；
所述信号肽1为具有如下功能的信号肽：将与其融合的目的蛋白展示于细菌内膜
外侧；
所述信号肽2为具有如下功能的信号肽：将与其融合的目的蛋白运送到细菌间质
腔后自身完全降解，所述目的蛋白游离于所述细菌间质腔内；
(b2)将所述重组表达载体库中的各重组表达载体转入宿主细菌，得到重组细菌
库；所述重组细菌库中各重组细菌中均含有任一种所述重组表达载体；
(b3)培养所述重组细菌库，诱导所述重组表达载体进行表达，由所述待检测单
链抗体编码基因编码所得的待检测单链抗体被展示于所述细菌内膜外侧，由所述靶标
抗原-标签蛋白融合基因编码所得的靶标抗原-标签融合蛋白游离于所述细菌间质腔
内；
(b4)去除所述重组细菌库中各重组细菌的外膜，得到原生质球...

【专利技术属性】
技术研发人员：李德山，白银，徐黎明，
申请(专利权)人：哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23