本发明专利技术属于水产动物基因工程技术领域，具体涉及一种分离的鲤抗病毒天然免疫蛋白TRIM32及抗病毒活性。所述的鲤抗病毒天然免疫蛋白TRIM32基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中第1-1986bp所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。试验表明本发明专利技术克隆的TRIM32蛋白的表达可以影响鲤春病毒血症病毒(SVCV)的增殖，且TRIM32蛋白在SVCV的生活周期中发挥着重要作用。本发明专利技术的基因或蛋白为制备抗SVCV药物的研究提供了新的靶点。
【技术实现步骤摘要】
分离的鲤抗病毒天然免疫蛋白TRIM32及抗病毒活性
本专利技术属于淡水鱼类基因工程
，具体涉及一种分离的鲤抗病毒天然免疫蛋白TRIM32及抗病毒活性。
技术介绍
鲤春病毒血症，是由鲤春病毒血症病毒(SVCV)引起的一种重要水生动物疾病，属于国际兽疫局(OIE)规定必须申报的动物疫病。在我国，农业部也将之列为二类动物疫病。SVCV是一种弹状病毒。现被列为弹状病毒科、水泡口炎病属的暂定成员。该病毒感染有很高的死亡率，造成巨大的经济损失。鱼苗一旦感染此病，表现为游动缓慢，兴奋度变低，停留在池塘底部或聚集在水中，反应迟钝并直至死亡。病鱼在外观上主要表现为体内出血、腹膜炎、内脏出血斑点。同时，SVCV能感染青鱼、草鱼、链鱼、鳙鱼和其他几种鲤科鱼。因此，SVC一直是国际上高度关注的一种鱼类病毒性传染病。我国目前没有大规模爆发该病的报道。但已有文献报道我国已从未出现任何症状的鲤鱼、金鱼等观赏性鱼中分离鉴定出SVCV。这对我国观赏鱼类的出口造成了极为严重的影响。因此，加强SVCV的抗病毒研究，寻求有效的预防和治疗方法是当务之急。天然免疫，即固有免疫或先天性免疫，是机体与生俱来的能够抵御微生物或外来异物侵袭的生理机能，是机体自身防御的第一道防线，具有快速反应性、非特异性、普遍性、多样性等特点。在抗病毒天然免疫中，泛素化扮演着至关重要的角色。泛素是一种存在于真核细胞中的高度保守的小分子蛋白质，其表达十分广泛。全长有76个氨基酸，分子量为8kD。泛素能够在一系列酶的催化下以共价键结合形式连接到靶蛋白上，完成对靶蛋白的泛素化修饰。这种蛋白翻译后修饰形式可以影响各种不同蛋白分子的定位、表达水平及活性等，从而广泛参与机体生命活动的各个方面，比如细胞周期、分化、调亡、转移、信号传递、炎症反应和基因转录等。泛素化过程主要由三种泛素相关蛋白酶完成，它们分别是E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶。而近年来，发现了一种新的与泛素化有关的蛋白家族-TRIM家族。TRIM(Tripartitemotif)家族的名称是由于其具有3个保守的结构域而得来。这三个结构域从N端到C端的顺序依次是RING结构域(RINGdomain)、1个或2个B-box结构域、一个卷曲螺旋结构域(Coiled-coildomain)，此外该家族还具有一个可变的C末端，因此TRIM家族也称为RBCC家族。RING结构域为锌指结构域，具有E3泛素连接酶活性，介导蛋白自身或不同底物的泛素化。另外参与蛋白间相互作用，并与抗病毒活性相关。B-box结构域也与锌原子结合，在TRIM蛋白中普遍存在，可能与E3泛素连接酶活性有关。卷曲螺旋结构域参与蛋白间同源或异源寡聚作用；而羧基端的SPRY结构域在TRIM蛋白发挥多种生物学功能中起着重要作用。自从1991年TRIM(RBCC)蛋白家族第一个成员XNF7被克隆鉴定后，目前人类基因组已发现和鉴定了近70个TRIM蛋白成员，在鱼类中就有100多种。并且其家族成员的功能越来越受到重视。研究表明TRIM家族的成员参与了细胞分化、增殖、发育、凋亡等许多重要的生物学过程。最近的研究表明部分TRIM蛋白具有抗病毒功能，尤其是对逆转录病毒具有限制作用，并且参与了与天然免疫相关一系列生物过程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种鲤抗病毒天然免疫蛋白(TRIM32)，同时研究该免疫蛋白(TRIM32)在鲤抗病毒活性中的应用。本专利技术通过克隆技术在鲤中分离得到一种鲤抗病毒天然免疫蛋白TRIM32基因，其核苷酸序列是SEQIDNO:1中第1-1986bp所示的序列。申请人同时得到该分离的鲤抗病毒天然免疫蛋白TRIM32，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。试验表明本专利技术克隆的TRIM32蛋白的表达可以影响鲤春病毒血症病毒(SVCV)的增殖，且TRIM32蛋白在SVCV的生活周期中发挥着重要作用。本专利技术的基因或蛋白为制备抗SVCV药物的研究提供了新的靶点。更详细的技术方案和专利技术效果参见《具体实施方式》所述。附图说明序列表SEQIDNO：1是鲤抗病毒天然免疫蛋白TRIM32基因的核苷酸序列(1-1986bp)，序列全长为1986bp,其中第1-1986bp也是该基因编码区(CDS),显示对应的氨基酸序列。序列表SEQIDNO：2是鲤抗病毒天然免疫蛋白TRIM32基因编码的蛋白质序列。图1.TRIM32核心片段的扩增结果。附图标记说明：泳道M：DNAMarker5000；泳道1，2，3：核心片段。图2.TRIM32基因扩增结果。附图标记说明：泳道M：DNAMarker5000；泳道1：TRIM32片段图3.利用间接免疫荧光法检测TRIM32转染后的表达情况。附图标记说明：图3中的A图为转染pCDNA4TM-/TO/-myc-HisA的对照组：图3中的B图为转染pCDNA4TM-/TO/-TRIM32-myc-HisA的实验组。图4.利用免疫印记法检测TRIM32过表达情况。附图标记说明：泳道1：转染pCDNA4TM-/TO/-TRIM32-myc-HisA组；泳道2：转染pCDNA4TM-/TO/-myc-HisA空载体组。图5：病毒滴度测定结果：pCDNA4TM-/TO/-TRIM32-myc-HisA/pCDNA4TM-/TO/-myc-HisA转染EPC细胞24小时后，用0.1MOI的SVCV感染，并在感染后12，24，36，48小时分别收取实验组和对照组的上清液，进行病毒滴度测定。图6：是本专利技术应用的pCDNA4TM/TO/-myc-HisA空载体的图谱(5151bp)。图7：本专利技术制备的重组表达质粒pCDNA4TM-/TO/-TRIM32-myc-HisA(7134bp)。具体实施方式实施例1(1)鲤的RNA提取取大小为300g左右的雌性鲤，解剖后取绿豆大小的卵巢组织(50-100mg)，加入1mlTRIzol试剂，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。在4℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。将水相转移到新管中，加入1/5水相体积的氯仿，震荡混匀，冰上静置5分钟，4℃10000×g离心15分钟。取上清于一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，冰上静置10分钟，4℃，10000×g离心10分钟。去上清液，加入75％的乙醇洗涤沉淀。在4℃，10000×g离心5分钟，向离心管中加入适量无RNA酶的水溶解RNA，-80℃备用。(2)反转录获取鲤总cDNA采用宝生物工程大连有限公司的(TAKARA)反转录试剂盒，按照试剂盒的说明书操作，具体步骤如下：取5×gDNAEraserBuffer2ul，gDNAEraser1ul，上述所提RNA1ug，加入到RNA反转录专用EP管中，加入适量无RNA酶水，补足体系至10ul。42℃，2分钟，马上置于冰上。向上述10ul反应液中，加入5×PrimeScriptBuffer24ul，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1ul，RTPrimerMix1ul，以及适量的无RNA酶水补足体系至20ul。37℃，15分钟；85℃，5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的鲤抗病毒天然免疫蛋白TRIM32基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO:1中第1‑1986bp所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种分离的鲤抗病毒天然免疫蛋白TRIM32基因在制备抗鲤春病毒血症病毒药物组合物中的应用，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列是SEQIDNO:1中第1-1986...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘学芹，李泽明，张琪，王业大，袁军法，贾路路，吴术盛，彭俊杰，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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