新型成纤维细胞生长因子-21类似物在治疗弥漫性间质性肺脏疾病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种成纤维细胞生长因子‑21改造工艺，及改造后的新型成纤维细胞生长因子‑21类似物在治疗弥漫性间质性肺脏疾病治疗和/或预防中的应用。本发明专利技术还保护一种治疗和/或预防弥漫性间质性肺脏疾病的药物，其活性成分为成纤维细胞生长因子‑21类似物。本发明专利技术发现成纤维细胞生长因子‑21类似物能够有效抑制弥漫性间质性肺脏疾病的发生，可作为药物治疗和/或预防弥漫性间质性肺脏疾病，对于弥漫性间质性肺脏疾病的治疗和预防具有重大价值。

Application of new fibroblast growth factor -21 analogue in the treatment of diffuse interstitial lung disease

The present invention discloses a modification process of fibroblast growth factor_21 and the application of a novel fibroblast growth factor_21 analogue after modification in the treatment and/or prevention of diffuse interstitial lung disease. The invention also provides a drug for the treatment and/or prevention of diffuse interstitial lung disease, the active ingredient of which is fibroblast growth factor_21 analogue. It is found that fibroblast growth factor 21 analogue can effectively inhibit the occurrence of diffuse interstitial lung disease, and can be used as drug therapy and/or prevention of diffuse interstitial lung disease. It is of great value for the treatment and prevention of diffuse interstitial lung disease.

【技术实现步骤摘要】
新型成纤维细胞生长因子-21类似物在治疗弥漫性间质性肺脏疾病中的应用
本专利技术涉及成纤维细胞生长因子-21改造工艺，及经过改造后的新型成纤维细胞生长因子-21类似物的一种新用途，即新型成纤维细胞生长因子-21类似物在治疗弥漫性间质性肺脏疾病中的应用。
技术介绍
弥漫性间质性肺脏疾病是众多肺部疾病发展到晚期的共同结局，其主要病理特征是慢性肺间质性炎症、成纤维细胞的活化增殖、细胞外基质（Extracellularmatrixc，ECM）的过度沉积，最终导致肺的组织结构破坏、功能受损、呼吸衰竭，甚至死亡。研究表明，弥漫性间质性肺脏疾病的发病因素众多，目前约有200种，包括自身免疫性疾病、药物、环境、感染、遗传等。还有部分弥漫性间质性肺脏疾病因诱因不明，被称为特发性肺纤维化（IPF），严重程度与肺癌相当，5年的生存率只有30%～50%。据保守估计，我国现有弥漫性间质性肺脏疾病患者320万人，平均每天增加10位患者，死亡2位，且发病率也在呈现急剧上升趋势，已经成为严重危害人体健康的重要疾病之一。目前，用于治疗弥漫性间质性肺脏疾病的药物种类主要包括抗炎药物、抗氧化剂、中药、抗纤维化药物以及基因工程抗体等。特异性抗纤维化的药物仅有吡非尼酮和尼达尼布，临床疗效较好。于2014年10月被美国FDA批准，可有效减缓轻至中度IPF患者的肺功能衰退，延缓疾病进展。但是，两者均会导致明显的副作用，如吡非尼酮导致胃肠道和皮肤过敏反应，尼达尼布引起腹泻等。所以，目前临床上仍然缺乏安全而有效的特异性治疗弥漫性间质性肺脏疾病的药物。此外，随着弥漫性间质性肺脏疾病的致病机制研究的逐渐深入，研究者又开发了用于弥漫性间质性肺脏疾病治疗的新药物和新途径，但大部分研究仍处于临床前或临床研究阶段。因此，研究治疗弥漫性间质性肺脏疾病更加安全和有效的药物成为全世界科研工作者的竞争的焦点之一。弥漫性间质性肺脏疾病的主要分子机制包括炎症反应、肺成纤维细胞到肌成纤维细胞的转化、上皮细胞-间充质细胞转化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）、基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinase，MMPs）/金属蛋白酶组织抑制剂（Tissueinhibitorofmetalloproteinase，TIMP）失衡、氧化应激和相关的信号传导通路活化等。近年来，研究发现EMT是弥漫性间质性肺脏疾病发生的重要机制之一。在弥漫性间质性肺脏疾病发生的过程中，肺泡上皮细胞失去其上皮的结构和功能，转变成间充质细胞-肌成纤维细胞，进而分泌大量的ECM聚集在肺部，导致肺脏瘢痕和僵硬，从而形成弥漫性间质性肺脏疾病。肺泡上皮细胞发生EMT时，其上皮细胞标志物如E-钙黏蛋白（E-cadherin）、角蛋白（keratin）等消失，进而出现α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）等间质细胞标志物。现阶段国内外大量研究均证实，TGF-β1在EMT的发生和发展中起到了重要作用。大量研究发现，氧化应激产生的ROS可以促进TGF-β1的表达和活化。因此，提高机体的抗氧化能力，可抑制TGF-β1的表达和活化，进而抑制EMT，有效缓解弥漫性间质性肺脏疾病。成纤维细胞生长因子-21因具有调节糖脂代谢等功能成为研究的焦点。但其作用效果缺乏稳定性，确切的作用还有待进一步验证。药物基因本身的结构和活性是决定其作用的效果及稳定性的重要因素之一。因此，对人源成纤维细胞生长因子-21进行分子改造及优化表达，已成为该领域近年来研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供成纤维细胞生长因子-21改造工艺，及改造后成纤维细胞生长因子-21类似物在治疗弥漫性间质性肺脏疾病中的应用。本专利技术还保护一种治疗和/或预防弥漫性间质性肺脏疾病的药物，其活性成分为成纤维细胞生长因子-21类似物。所述药物还包括其它药学上可接受的载体或辅料。所述药物中，除了所述活性成分外，可以添加药学上允许的赋形剂、填充剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、增效剂和添加剂等。所述药物的给药形态可为针剂（如粉剂、水剂、油剂）。所述制剂都可采用本领域技术人员熟知常用的制备方法而获得。所述药物的给药途径可为皮下注射、静脉注射或肌肉注射。以上任一所述成纤维细胞生长因子-21类似物为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有治疗和/或预防弥漫性间质性肺脏疾病的功能的由序列1衍生的蛋白质。所述成纤维细胞生长因子-21类似物对弥漫性间质性肺脏疾病的治疗作用体现为（c1）至（c7）中的至少一种：（c1）抑制弥漫性间质性肺脏疾病发生；（c2）抑制弥漫性间质性肺脏疾病程度；（c3）降低肺脏中胶原纤维和/或肌纤维的水平；（c4）降低肺脏中羟脯氨酸的水平；（c5）降低肺脏中I型胶原蛋白和/或α-平滑肌肌动蛋白的水平；（c6）降低肺脏中TGF-β1水平；（c7）提高肺脏中Nrf2水平，提高机体抗氧化能力，抑制TGF-β1水平。以上任一所述成纤维细胞生长因子-21类似物具体可采用包括如下步骤的方法制备：（1）表达所述成纤维细胞生长因子-21类似物与分子伴侣的融合蛋白；（2）收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侣后得到所述成纤维细胞生长因子-21类似物。所述分子伴侣具体可为分子泛素样修饰蛋白（即分子伴侣SUMO）。所述“表达所述成纤维细胞生长因子-21类似物与分子伴侣的融合蛋白”的实现方法如下：将所述成纤维细胞生长因子-21类似物的编码基因插入原核表达载体pSUMO，得到重组质粒；将所述重组质粒导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌；发酵所述重组菌并采用IPTG进行诱导，得到所述融合蛋白。所述“切除所述分子伴侣”的实现方式如下：取所述融合蛋白，用SUMO蛋白酶I（SUMO蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比具体可为1:50）和DTT（所述DTT的初始浓度可为2mmol/L）切割（切割条件具体可为4℃切割过夜）。所述成纤维细胞生长因子-21类似物的编码基因具体可为如下1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中序列2所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；3）与1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。本专利技术发现改造后的成纤维细胞生长因子-21类似物能够有效抑制弥漫性间质性肺脏疾病的发生，且作用效果显著优于人源成纤维细胞生长因子-21，可作为药物治疗和/或预防弥漫性间质性肺脏疾病，对于弥漫性间质性肺脏疾病的治疗和预防具有重大价值。附图说明图1为成纤维细胞生长因子-21类似物的聚丙烯凝胶电泳图。图2为HE染色结果。图3为Masson染色结果和表面密度。图4为羟脯氨酸含量检测结果。图5为TGF-β1、I型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和E-钙黏蛋白基因相对β-actin基因转录水平的表达变化。图6为TGF-β1、I型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和E-钙黏蛋白基因相对β-act本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人源成纤维细胞生长因子‑21基因的改造工艺及改造后的新型成纤维细胞生长因子‑21类似物在治疗和/或预防弥漫性间质性肺脏疾病中的应用。

【技术特征摘要】
1.人源成纤维细胞生长因子-21基因的改造工艺及改造后的新型成纤维细胞生长因子-21类似物在治疗和/或预防弥漫性间质性肺脏疾病中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述成纤维细胞生长因子-21类似物为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有治疗和/或预防弥漫性间质性肺脏疾病的功能的由序列1衍生的蛋白质。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述成纤维细胞生长因子-21类似物对弥漫性间质性肺脏疾病的治疗作用体现为（c1）至（c7）中的至少一种：（c1）抑制弥漫性间质性肺脏疾病发生；（c2）抑制弥漫性间质性肺脏疾病程度；（c3）降低肺脏中胶原纤维和/或肌纤维的水平；（c4）降低肺脏中羟脯氨酸的水平；（c5）降低肺脏中I型胶原蛋白和/或α-平滑肌肌动蛋白的水平；（c6）降低肺脏中TGF-β水平；（c7）提高肺脏中Nrf2水平，提高机体抗氧化能力，...

【专利技术属性】
技术研发人员：于丹，张胜奇，李德山，
申请(专利权)人：哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23